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溃疡性结肠炎是一种病因尚不十分明确的结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，病变局限于大肠黏膜及黏膜下层[1]。病变多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠，甚至整个结肠。其病程漫长，常反复发作，可见于任何年龄，以20~30岁最为多见[2-3]。miRNA是一类长约22个核苷酸、高度保守的内源性非编码小分子RNA。研究[4-5]表明，miRNA表达与人类溃疡性结肠炎密切相关，其异常表达影响溃疡性结肠炎的发生和发展。本研究旨在探讨miR-595、miR-1246在溃疡性结肠炎病人血清中的表达及其与肠道菌群的相关性。现作报道。
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选取2019年1月至2020年1月我院收治的溃疡性结肠炎病人160例作为观察组，均符合中华医学会消化病学分会溃疡性结肠炎协作组制定的诊断标准[6]，并根据疾病活动性将病人分为活动期(aUC组)和缓解期(rUC组)，各80例。其中aUC组男42例，女38例，年龄(43.62±5.21)岁；rUC组男40例，女40例，年龄(44.65±2.34)岁。排除标准：(1)纳入研究前4周内服用抗生素、益生菌等药物者；(2)严重心脑血管疾病者；(3)自身免疫性疾病者。同期选取我院健康体检者158名作为对照组。各组性别、年龄均具有可比性。
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抽取各组静脉血5 mL，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，吸取上清，-80 ℃保存备用。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-595、miR-1246表达水平，Trizol提取血清中总RNA，采用反转录试剂盒将总RNA合成cDNA。RT-qPCR试剂盒实时荧光定量。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。miR-595上游引物：5′-GXG AAG TGT GCC GTG GT-3′，下游引物：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；miR-1246上游引物：5′-ACA CTC CAG CTG GGA ATG GAT TTT TGG-3′，下游引物：5′-ACT GAC TGA TGC AAT CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3′；U6上游引物：5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，下游引物：5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。采用ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-22水平，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，严格按说明书进行操作。
取各组受试者自然排出新鲜粪便约10 g，置于厌氧罐中，立即送往实验室检测。取新鲜粪便0.5 g，按10倍系列稀释法稀释粪便，分别用MRS琼脂培养基培养乳酸杆菌，双歧杆菌BS培养基培养双歧杆菌，肠球菌培养基培养粪肠球菌，麦康凯琼脂板培养大肠埃希菌。乳酸杆菌和双歧杆菌厌氧培养72 h，大肠埃希菌和粪肠球菌需氧培养48 h。结果以每克粪便湿质量中菌落形成单位的对数值logCFU(g)表示。
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采用方差分析、q检验和Pearson相关分析。
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aUC组和rUC组病人血清miR-595、miR-1246表达水平均高于对照组(P < 0.05)，aUC组亦均高于rUC组(P < 0.05)(见表 1)。
分组 n miR-595 miR-1246 对照组 158 1.00±0.09 1.02±0.11 rUC组 80 1.12±0.10* 1.20±0.12* aUC组 80 2.09±0.25*# 2.56±0.46*# F — 1501.68 1058.68 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.022 0.063 q检验：与对照组比较*P < 0.05；与rUC组比较#P < 0.05 表 1 3组血清miR-595、miR-1246表达水平比较(x±s)
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aUC组和rUC组病人血清TNF-α、IL-6、IL-22水平均高于对照组(P < 0.05)，aUC组亦均高于rUC组(P < 0.05)(见表 2)。
分组 n TNF-α/(ng/L) IL-6/(ng/L) IL-22/(ng/L) 对照组 158 135.68±16.38 125.64±8.61 324.61±58.30 rUC组 80 148.30±14.01* 131.05±12.11* 368.01±69.90* aUC组 80 255.68±29.09*# 234.80±20.35*# 824.62±88.66*# F — 1 025.82 1 946.75 1 452.56 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 395.181 177.587 4 890.818 q检验：与对照组比较*P < 0.05；与rUC组比较#P < 0.05 表 2 3组血清TNF-α、IL-6、IL-22水平比较(x±s)
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aUC组和rUC组乳酸杆菌、双歧杆菌数量均低于对照组(P < 0.05)，aUC组亦均低于rUC组(P < 0.05)；aUC组肠球菌、大肠埃希菌数量均明显高于对照组和rUC组(P < 0.05)(见表 3)。
分组 n 乳酸杆菌 双歧杆菌 肠球菌 大肠埃希菌 对照组 158 8.33±1.10 8.62±0.82 6.38±1.20 7.23±1.35 rUC组 80 8.01±0.99* 7.28±0.85* 6.51±1.31 7.36±1.48 aUC组 80 6.32±0.82*# 5.30±0.67*# 8.68±1.56*# 9.62±1.82*# F — 109.16 467.79 86.93 72.21 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 1.018 0.629 1.758 2.288 q检验：与对照组比较*P < 0.05；与rUC组比较#P < 0.05 表 3 3组肠道菌群数量比较(x±s；CFU/g)
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Pearson相关分析显示，miR-595、miR-1246表达和TNF-α、IL-6、IL-22水平与乳酸杆菌、双歧杆菌数目均呈负相关关系(P < 0.05)，而以上指标与肠球菌、大肠埃希菌数目均呈正相关关系(P < 0.05)(见表 4)。
项目 miR-595 miR-1246 TNF-α IL-6 IL-22 乳酸杆菌 -0.421* -0.328* -0.351* -0.384* -0.386* 双歧杆菌 -0.385* -0.359* -0.310* -0.362* -0.401* 肠球菌 0.362* 0.382* 0.286* 0.379* 0.396* 大肠埃希菌 0.297* 0.364* 0.358* 0.326* 0.418* *P < 0.05 表 4 血清指标与肠道菌群的相关性(r)
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溃疡性结肠炎是一组慢性非特异性肠道炎症性疾病，易反复发作，严重影响病人的生活质量。有研究[7-8]表明，溃疡性结肠炎在我国发病率呈每年上升趋势。miRNA是一类非蛋白编码单链小分子RNA，可以影响溃疡性结肠炎的发生发展，主要发挥了调节免疫炎症反应，影响肠屏障的功能[9]。已经有研究[10]发现，miR-595在溃疡性结肠炎病人中的表达水平明显高于健康对照组。且吴智娇[11]研究发现，miR-1246在溃疡性结肠炎中的表达水平明显提高。本研究结果显示，与对照组和rUC组比较，aUC组病人血清miR-595、miR-1246表达水平升高；与对照组比较，rUC组病人血清miR-595、miR-1246表达水平亦升高。
肠道菌群紊乱会刺激肠道发生炎症，提高炎性因子水平。研究[12]表明，TNF-α和IL-6在溃疡性结肠炎中的水平明显上调。另有研究[13]显示，溃疡性结肠炎病人血清TNF-α和IL-35水平明显增加，具有重要临床意义。李息友等[14-15]研究表明，溃疡性结肠炎病人IL-22水平高于健康者。本研究结果显示，与对照组和rUC组比较，aUC组TNF-α、IL-6、IL-22水平均升高；与对照组比较，rUC组TNF-α、IL-6、IL-22水平亦均升高。
杨文宏等[16]研究表明，溃疡性结肠炎病人肠道菌群失衡，其发病与菌群数量的减少和增加有关。叶雅丽等[17]研究表明，活动期溃疡性结肠炎病人大肠埃希菌、肠球菌数量明显升高，但双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显降低，呈失衡状态。田丽等[18]研究表明，溃疡性结肠炎病人有害菌含量增加，有益菌含量减少。本研究发现，与对照组比较，aUC组乳酸杆菌、双歧杆菌数量降低，肠球菌、大肠埃希菌数量升高；与rUC组比较，aUC组乳酸杆菌、双歧杆菌数量降低，肠球菌、大肠埃希菌数量升高。研究[19]表明，溃疡性结肠炎病人的肠道菌群分布与血清TNF-α、IL-6水平密切相关。亦有研究[20]显示，溃疡性结肠炎病人肠道菌群变化与炎性因子具有相关性。本研究结果显示，miR-595、miR-1246表达水平和血清TNF-α、IL-6、IL-22水平与乳酸杆菌、双歧杆菌数量均呈负相关关系，与肠球菌、大肠埃希菌数量均呈正相关关系。
综上所述，溃疡性结肠炎病人血清miR-595、miR-1246表达上调，且与肠道菌群数量呈相关关系。
miR-595、miR-1246在溃疡性结肠炎血清中的表达及其与肠道菌群相关性研究
Expression of miR-595 and miR-1246 in serum of ulcerative colitis and its correlation with intestinal flora
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摘要:
目的探讨miR-595、miR-1246在溃疡性结肠炎血清中的表达及其与肠道菌群相关性。 方法选取溃疡性结肠炎病人160例作为观察组，并根据疾病活动性分为活动期(aUC组)和缓解期(rUC组)，各80例。同期选取健康体检者158名作为对照组。采用实时荧光定量PCR法检测各组血清中miR-595、miR-1246表达水平；采用ELISA法检测各组血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-22水平；采集各组新鲜粪便，使用梯度稀释法对菌群进行培养。 结果aUC组和rUC组病人miR-595、miR-1246表达和TNF-α、IL-6、IL-22水平均高于对照组(P < 0.05)，aUC组亦均高于rUC组(P < 0.05)。aUC组和rUC组乳酸杆菌、双歧杆菌数量均低于对照组(P < 0.05)，aUC组亦均低于rUC组(P < 0.05)；aUC组肠球菌、大肠埃希菌数量均明显高于对照组和rUC组(P < 0.05)。Pearson相关分析显示，miR-595、miR-1246表达水平和TNF-α、IL-6、IL-22水平与乳酸杆菌、双歧杆菌数目均呈负相关关系(P < 0.05)，而以上指标与肠球菌、大肠埃希菌数目均呈正相关关系(P < 0.05)。 结论溃疡性结肠炎病人血清中miR-595、miR-1246表达上调，且与肠道菌群数量存在相关关系。 Abstract:ObjectiveTo explore the expression of miR-595 and miR-1246 in serum of ulcerative colitis and its correlation with intestinal flora. MethodsA total of 160 patients with ulcerative colitis were selected as the observation group.According to the disease activity, the patients were divided into active phase (aUC group) and remission phase (rUC group), with 80 cases in each group.During the same period, 158 healthy people for physical examination were selected as the control group.Real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the expression levels of serum miR-595 and miR-1246.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect serum tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), and interleukin-22 (IL-22) levels.Fresh feces of patients and healthy people were collected, and gradient dilution method was used to culture and analyze the flora. ResultsThe expression levels of miR-595, miR-1246, TNF-α, IL-6 and IL-22 in the aUC and rUC group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05), and which in the aUC group were higher than those in the rUC group (P < 0.05).The number of lactobacillus and bifidobacteria in the aUC group and rUC group were lower than those in the control group (P < 0.05), and which in the aUC group were lower than those in the rUC group (P < 0.05).The number of enterococcus and Escherichia coli in aUC group was significantly higher than that in control group and rUC group (P < 0.05).Pearson correlation analysis showed that the expression levels of miR-595, miR-1246, TNF-α, IL-6 and IL-22 were negatively correlated with the number of lactobacilli and bifidobacteria (P < 0.05), and positively correlated with the number of enterococci and Escherichia coli (P < 0.05). ConclusionsThe expression of miR-595 and miR-1246 in the serum of ulcerative colitis is significantly up-regulated, and closely related to the number intestinal flora. -
Key words:
- ulcerative colitis /
- miR-595 /
- miR-1246 /
- intestinal flora
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表 1 3组血清miR-595、miR-1246表达水平比较(x±s)
分组 n miR-595 miR-1246 对照组 158 1.00±0.09 1.02±0.11 rUC组 80 1.12±0.10* 1.20±0.12* aUC组 80 2.09±0.25*# 2.56±0.46*# F — 1501.68 1058.68 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.022 0.063 q检验：与对照组比较*P < 0.05；与rUC组比较#P < 0.05 
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表 2 3组血清TNF-α、IL-6、IL-22水平比较(x±s)
分组 n TNF-α/(ng/L) IL-6/(ng/L) IL-22/(ng/L) 对照组 158 135.68±16.38 125.64±8.61 324.61±58.30 rUC组 80 148.30±14.01* 131.05±12.11* 368.01±69.90* aUC组 80 255.68±29.09*# 234.80±20.35*# 824.62±88.66*# F — 1 025.82 1 946.75 1 452.56 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 395.181 177.587 4 890.818 q检验：与对照组比较*P < 0.05；与rUC组比较#P < 0.05
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表 3 3组肠道菌群数量比较(x±s；CFU/g)
分组 n 乳酸杆菌 双歧杆菌 肠球菌 大肠埃希菌 对照组 158 8.33±1.10 8.62±0.82 6.38±1.20 7.23±1.35 rUC组 80 8.01±0.99* 7.28±0.85* 6.51±1.31 7.36±1.48 aUC组 80 6.32±0.82*# 5.30±0.67*# 8.68±1.56*# 9.62±1.82*# F — 109.16 467.79 86.93 72.21 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 1.018 0.629 1.758 2.288 q检验：与对照组比较*P < 0.05；与rUC组比较#P < 0.05
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表 4 血清指标与肠道菌群的相关性(r)
项目 miR-595 miR-1246 TNF-α IL-6 IL-22 乳酸杆菌 -0.421* -0.328* -0.351* -0.384* -0.386* 双歧杆菌 -0.385* -0.359* -0.310* -0.362* -0.401* 肠球菌 0.362* 0.382* 0.286* 0.379* 0.396* 大肠埃希菌 0.297* 0.364* 0.358* 0.326* 0.418* *P < 0.05
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