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慢性骨髓炎是由化脓性细菌引起的慢性炎症，常造成骨或周围软组织的坏死或破坏。细菌生物膜的形成是阻碍抗菌类药物渗透至感染部分，限制抗菌效果的重要原因。当细菌附着于物体表面，能分泌一些细胞外大分子物质，将自身包裹形成一种特殊的内部生态环境[1]。在坏死的软骨组织、骨感染微生物后，同样能在其表面形成一种生物膜。生物膜的存在大大提高了细菌对抗菌药物的抵抗能力，导致细菌难以彻底清除，最终使慢性骨髓炎反复发作、感染[2]。
1994年，美国食品和药品监督管理局首次批准超声波作为一种安全、无创的辅助治疗手段，应用于促进新鲜骨折愈合的辅助治疗。研究证实，超声波对于骨不连预后[3]、关节退行性疾病[4]的恢复具有良好的促进作用。研究[5]证实，超声波能有效杀灭金黄色葡萄球菌并显著破坏细菌生物膜[5]。BIGELOW等[6]研究证实高强度聚集超声能有效破坏体外大肠杆菌的生物膜结构。超声波主要原理利用了其空化效应、机械效应及热效应杀菌及破坏细菌生物膜。因此，在慢性骨髓炎治疗过程中，是否可以辅助超声治疗，来破损细菌生物膜，从而到达抑制细菌生长，改善慢性骨髓炎局部微环境，提高临床治疗效果，是值得研究的。
铜绿假单胞杆菌是医院感染的主要病原微生物之一，近年来发现因其感染的比例呈上升趋势，继金黄色葡萄球菌之后排在第二位，备受研究人员的广泛关注。研究[7]证实，细菌生物膜的形成是导致铜绿假单胞杆菌耐药的关键原因，在抵抗抗生素发挥抗菌作用过程中扮演重要作用。
神经网络是基于现代神经科学研究基础对生物神经系统的结构和功能进行数学抽象、简化和模仿而逐步发展起来的一种新型信息处理和计算系统[8]。相比响应面分析，能克服响应面分析法中二次多项式的一些局限性，更全面地反映参数与输出结果的关系[9]。因此，本研究预通过铜绿假单胞杆菌感染诱导慢性骨髓炎模型，研究超声波对铜绿假单胞杆菌的抑菌作用，以细菌膜抑菌数为指标，采用神经网络优化超声波灭菌参数，并应用于辅助治疗铜绿假单胞杆菌诱导的兔慢性骨髓炎模型动物，从抑菌角度评价超声波辅助治疗慢性骨髓炎的效果。
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铜绿假单胞杆菌(ATCC9072)购买于广州环凯微生物科技有限公司。
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健康成年新西兰兔40只，普通级，来源于蚌埠医学院动物中心，自由饮水，体质量2.5~3.0 kg，饲养环境湿度45%~65%，温度25 ℃左右。
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将铜绿假单胞杆菌接种于胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB肉汤)中，培养24 h，收集铜绿假单胞杆菌，采用液体TSB培养基悬浮细菌，并调节细菌的浓度为106 cfu/mL，备用。取1个三角瓶，加入TSB培养基，然后再放入一盖玻片，取100 μL上述106 cfu/mL的菌悬液于三角瓶中，然后将三角瓶放入恒温摇床中培养，培养48 h后，取出盖玻片，采用无菌0.9%氯化钠溶液漂洗，去除浮游菌，观察贴壁生长细菌数。
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将0.9%氯化钠溶液漂洗的载玻片放置于-20 ℃ 0.9%氯化钠溶液中，超声波震荡，功率180 W，时间1.5 min，使贴壁的细菌脱落进入0.9%氯化钠溶液中，然后取0.1 mL的菌悬液涂布于营养琼脂平皿中，37 ℃培养24 h，计算平板菌落数。通过菌落数的水平评价生物膜生长状况。膜片菌落数=(肉眼可计菌落数×稀释倍数)/膜片体积。
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以超声强度(X1)，频率为(X2)、处理时间(X3)为主变量因素，以膜片菌落数为响应变量。采用Box-behnken实验设计采集数据，因素水平见表 1。
因素 水平 -1 0 1 X1/(W/cm2) 10 30 50 X2/kHz 20 40 60 X3/min 5 10 15 表 1 实验设计因素水平
超声处理：将预超声的盖玻片浸入盛有脱气水的密闭容器中，在超声仪的治疗头涂布耦合剂，然后进行超声辐照。所有超声处理按工作时间1 s，间隙1 s处理。
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取新西兰兔，按1 mL/kg剂量向兔大腿肌肉注射3%的戊巴比妥，麻醉兔子，然后左侧卧位固定，消毒后，在股骨大转子下2 cm为切口起点，沿股骨方向做纵行切口1 cm，切开皮肤，逐层分离皮下筋膜肌肉，剥离局部骨膜后用3.5 mm钻头的电钻，在该处钻2个纵向相连、部分重叠的骨洞，直达髓腔，制成一个矩形骨窗，孔洞用无菌骨蜡密封。先用注射器抽取骨髓后，再向髓腔内注射0.1 mL的5%鱼肝油酸钠，后再向髓腔内注射0.5 mL的铜绿假单胞菌菌液(1×106 cfu/mL)。之后逐层缝合皮肤软组织，无菌敷料覆盖包扎，按统一标准饲养4周。
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将兔股骨慢性骨髓炎模型构建成功的新西兰兔分为4组，分别为对照组、阿奇霉素组、超声波处理组及超声波处理+阿奇霉素协同作用组。手术前1周每天采用阿奇霉素和超声波治疗1次，第2周后每3 d采用阿奇霉素和超声波治疗1次，连续养4周后，从伤口部取分泌物进行细菌培养，并对骨髓炎状况进行评分。
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采用Norden评分法评价骨髓炎状况，Norden骨髓炎评分法包含4个指标：死骨形成(有为3分，可疑为1.5分，无为0分)；骨质破坏(有为2分，可疑为1分，无为0分)；骨质增生(有为1分，可疑为0.5分，无为0分)；软组织炎性包块影(有为1分，可疑为0.5分，无为0分)。
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采用SPSS软件统计分析不同分组间的差异性，采用JMP软件进行神经网络优化。
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2.1.1数据的采集
采用Box-behnken设计实验，根据设计的实验模式点进行相关实验(见表 2)。
模式 X1/(W/cm2) X2/(KHz) X3/min 膜片菌落数/(cfu/cm3) --0 10 20 10 50 -+0 10 60 10 42 +-0 50 20 10 40 ++0 50 60 10 28 0-- 30 20 5 36 0-+ 30 20 15 31 0+- 30 60 5 30 0++ 30 60 15 22 -0- 10 40 5 40 +0- 50 40 5 32 -0+ 10 40 15 44 +0+ 50 40 15 28 000 30 40 10 30 000 30 40 10 32 000 30 40 10 33 表 2 Box-behnken实验设计及结果
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隐藏节点的确定在保证神经网络模型的准确性方面具有重要作用，隐藏节点过少常导致拟合不足，过多则导致拟合过多，因此需确定合适的隐藏节点。本研究将确定交叉验证组K为5的情况下，通过2~8个隐藏节点数进行模拟训练，每次训练重复5次，根据模拟训练得到的决定系数R2及交叉验证R2值来确定隐藏节点数据，模拟训练结果见图 1。
图 1 不同隐藏节点下相关系数R2和交叉验证R2
相关系数R2随着隐藏节点的增加而增加，并趋向平稳接近1。交叉验证R2随着隐藏节点的增加，先上升后下降并趋向平稳，在隐藏节点为4时，交叉验证R2最大，说明此节点为4时，拟合最优。因此本研究采用3×4×1结构的三层神经网络(见图 2)，3个神经元分别代表超声强度X1、频率X2及处理时间X3，另包含4个隐藏层神经元和1个输出神经元，输出神经元为膜片菌落数(Y值)。其他参数值，过拟合项0.001、历程数20，最大迭代数50，收敛准则0.000 01。通过上述参数拟合测得实际值和神经网络预测值之间具有非常好的相关性，相关系数R2达到了0.99，说明该神经网络模型有较好的拟合效果(见图 3)。
图 2 神经网络结构图
图 3 膜片菌落数测得值与预测值相关性
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本研究在确定神经网络模型的隐藏节点后，可通过曲面刻画器来观察超声强度、超声频率及超声时间对膜片菌落数的影响趋势，首先固定其中一个变量，然后观察两个变量的曲面变化趋势，结果见图 4。
图 4 超声强度、超声频率及超声时间对膜片菌落数的影响
超声强度与超声频率对膜片菌落数影响，结果显示, 超声强度40 W/cm2后，膜片菌落数变化趋于稳定；超声频率随着频率增加，膜片菌落数降低；超声频率受强度的影响较大，强度越大，超声频率越高，两者协同效果越好(见图 4A)。超声频率与超声时间对膜片菌落数的影响，结果显示，超声时间受超声强度的影响，随着强度增加，超声时间越长效果越明显，在超声前10 min，变化较缓，10 min后膜片菌落数下降较快(见图 4B)。声频率与超声时间对膜片菌落数的影响，结果显示，随超声频率增加，膜片菌落数快速下降，超声时间受超声频率影响，随超声频率增加，超声时间对膜片菌落数影响更明显(见图 4C)。
根据超声强度、超声频率及超声时间对膜片菌落数影响的规律，利用JMP软件预测刻画器优化超声波破坏细菌膜的处理参数，结果显示，当超声强度为39.95 W/cm2(取整数40 W/cm2)、超声频率为60 kHz，超声时间为15 min时，膜片菌落数最低，达19.82 cfu/cm3(见图 5)，因此，以此参数作为最优超声条件。在此条件下，本研究继续重复了3次平行实验，其菌落膜片数平均值为20.33，与预测值之间没有明显的差异，说明神经网络具有较好的预测功能。
图 5 神经网络预测刻画图
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采用细菌培养试验观察兔股骨中微生物感染情况，研究结果发现，对照组兔的股骨髓中均检测到铜绿假单胞杆菌，超声波组有8只检测到铜绿假单胞杆菌，阿奇霉素处理组有4只检测到铜绿假单胞杆菌，超声波加阿奇霉素处理组均未检测到铜绿假单胞杆菌。
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通过Norden评分对各组兔股骨慢性骨髓炎状况进行评分，结果显示，对照组Norden评分最高，所有兔评分均>4。虽然2组Norden评分差异无统计学意义(P>0.05)，但是Norden评分有下降趋势，且部分兔恢复效果较好，一半以上Norden评分≤4。超声协同阿奇霉素处理组效果最佳，Norden评分与对照组有明显的差异性，且总体恢复效果较好，有2只呈现完全恢复状况(见表 3)。
分组 n Norden评分 对照组 10 5.80±1.06 超声处理组 10 4.30±1.34 阿奇霉素处理组 10 4.55±1.23 超声+阿奇霉素处理 10 2.05±1.28 F — 16.06 P — ＜0.01 MS组内 — 1.518 表 3 各组兔Nordon评分比较(x±s；分)
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细菌生物膜的形成是影响慢性骨髓炎治疗的关键原因。为了体外探究超声波对细菌生物膜的影响，本研究采用了一种引导片法，该方法可直接观察生物膜的形成情况，另外通过超声震荡-活菌计算评价生物膜形成情况，结果稳定可靠[12]。基于此方法，本研究通过神经网络模型探究了超声强度、超声频率及超声时间对引导片法生物膜形成的影响，通过观察膜片菌落数反映生物膜破坏程度，膜片菌落数越少，生物膜破坏越严重。研究结果显示超声波的超声强度、超声频率及超声时间均影响生物膜的形成，呈协助作用，当超声强度越大时，超声频率和超声时间对细菌生物膜破坏越大，同样超声频率越大，超声强度和超声时间对生物膜破坏越大。这符合超声波灭菌理论。本研究最终确定的最优参数条件为：超声强度为40 W/cm3、超声频率为60 kHz、超声时间为15 min时，膜片菌落数最少，生物膜破坏最严重。
另外，进一步将超声波应用于兔股骨慢性骨髓炎模型的治疗。研究发现，超声波有一定的抑菌作用，但治疗效果并不佳，Norden评分及微生物感染兔仍较高。但是，当超声波与抗生素阿奇霉素协同治疗兔股骨慢性骨髓炎，表现为较好的治疗效果，在微生物感染或Norden评分方面均取得了较好的效果。这与临床文献[13]报道效果相一致，超声波应用于慢性骨髓炎病人的辅助治疗可以改善病人的生活质量，提高病人活动能力[13]。据相关文献[14]报道，超声波辅助治疗效果主要是通过其空化现象和机械效应发挥作用，超声波的空化过程中产生微泡，微泡的震动能产生剪切力和微射流，促进小分子物穿过细胞膜或界膜等结构，发挥作用。或许说明了超声波与抗生素协同效果较好的关键原因。
综上，经网络模型可较好的优化超声波的灭菌参数，有效地预测及验证了超声波灭菌的最佳参数。另外，证实超声波应用于慢性骨髓炎的治疗，单独作用效果有限，联合抗生素治疗效果更佳。
神经网络优化超声波对铜绿假单胞杆菌灭菌参数及在慢性骨髓炎中的应用
Optimization of ultrasonic sterilization parameters for Pseudomonas aeruginosa by neural network and its application in chronic osteomyelitis
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摘要:
目的从抗菌效果方面探讨超声波在慢性骨髓炎中辅助治疗效果。 方法采用神经网络模型体外优化超声波灭菌参数，根据其优化的参数应用于兔股骨慢性骨髓炎模型的治疗，通过微生物感染数及Norden评分评价超声波治疗慢性骨髓炎效果。 结果通过神经网络模型拟合，发现在隐藏节点4情况下，拟合效果最佳，最终确定最佳参数：超声强度为40 W/cm3、超声频率为60 kHz及超声时间为15 min，其膜片菌落数约为20 cfu/cm3，灭菌效果最佳。此参数应用于兔股骨慢性骨髓炎模型的治疗，发现与抗生素阿奇霉素协同作用效果最佳，在微生物感染及Norden评分方面均取得较好效果。 结论超声波可通过抑菌作用辅助慢性骨髓炎的治疗，其与抗生素的协同作用效果最佳。 Abstract:ObjectiveTo explore the effect of ultrasound in adjuvant treatment of chronic osteomyelitis from the aspect of antibacterial effect. MethodsThe neural network model was used to optimize the ultrasonic sterilization parameters in vitro, and the optimized parameters were applied to treat rabbit femoral chronic osteomyelitis model.The number of microbial infection and the Norden score were used to evaluate the effect of ultrasound treatment on chronic osteomyelitis. ResultsThrough fitting the neural network model, it was found that the fitting effect was the best in the case of hidden node 4, and the best parameters were as follows: 40 W/cm3 as the ultrasound intensity, 60 kHz as the ultrasound frequency, and 15 min as the ultrasound time, which resulted in the best sterilization effect.These parameters were applied to treat rabbit femoral chronic osteomyelitis model, and it was found that the antibiotic azithromycin had the best synergistic effect, which had good effects on microbial infection and Norden score. ConclusionsUltrasound can assist the treatment of chronic osteomyelitis through bacteriostasis, and its synergistic effect with antibiotics has the best effect. -
表 2 Box-behnken实验设计及结果
模式 X1/(W/cm2) X2/(KHz) X3/min 膜片菌落数/(cfu/cm3) --0 10 20 10 50 -+0 10 60 10 42 +-0 50 20 10 40 ++0 50 60 10 28 0-- 30 20 5 36 0-+ 30 20 15 31 0+- 30 60 5 30 0++ 30 60 15 22 -0- 10 40 5 40 +0- 50 40 5 32 -0+ 10 40 15 44 +0+ 50 40 15 28 000 30 40 10 30 000 30 40 10 32 000 30 40 10 33 
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表 3 各组兔Nordon评分比较(x±s；分)
分组 n Norden评分 对照组 10 5.80±1.06 超声处理组 10 4.30±1.34 阿奇霉素处理组 10 4.55±1.23 超声+阿奇霉素处理 10 2.05±1.28 F — 16.06 P — ＜0.01 MS组内 — 1.518
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