携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定

范迟; 高下; 徐琳; 朱光洁; 陈杰; 麻晓峰; 丁小琼; 陆玲; 周函

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定

范迟 , 高下 , 徐琳 , 朱光洁 , 陈杰 , 麻晓峰 , 丁小琼 , 陆玲 , 周函

文章导航 > 蚌埠医学院学报 > 2010, 35 > 1: (10-13)

引用本文:

Citation:

携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定

1. 东南大学医学院, 江苏南京 210009;
2. 南京大学医学院附属鼓楼医院耳鼻喉科, 江苏南京 210008

作者简介: 范迟(1983-),男,硕士研究生.

通讯作者: 高下, xiagao213@yahoocom.cn ;

基金项目:
江苏省重点人才项目基金资助(RC2007010)

南京市医学科技重点项目基金资助(ZKX06019)
中图分类号: R373.1

Construction and identification of recombinant adenovirus with NT-3 gene

1. Medical College, Southeast University, Nanjing Jiangsu 210009;
2. Department of Otorhinolaryngology, The Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing Jiangsu 210008, China

Corresponding author: GAO Xia, xiagao213@yahoocom.cn ;

CLC number: R373.1

摘要: 目的:构建含人神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒载体,为初步研究NT-3的在体功能做准备。方法:酶切法从已构建好的真核表达载体NT-3-pIRES2-DsRed2质粒中切下含有NT-3和DsRed2(包括连接区域pIRES2)的目的片段,将其插入到腺病毒骨架质粒pAdShuttle-CMV的多克隆位点中,电穿孔法将腺病毒骨架载体pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2和预转入人肠杆菌BJ5183的穿梭载体pAdEasy-1进行细菌内同源重组。PacⅠ酶切线性化鉴定正确的同源重组载体,脂质体法转染293T细胞,包装形成表达NT-3目的蛋白和红色荧光的腺病毒。通过293T细胞3轮扩增病毒,氯化铯密度梯度离心,获得高滴度的纯化腺病毒。Western blot方法检测蛋白表达情况。结果:同源重组质粒载体的DNA测序证实腺病毒载体中含有NT-3的目的片段,Western blot证实感染重组腺病毒的293T细胞中有相应的NT-3蛋白表达;病毒滴度为10⁹PFU/ml。结论:利用细菌内同源重组的方法可以成功构建同时表达NT-3蛋白和红色荧光的重组腺病毒。
- 腺病毒,人 /
- 人神经营养素-3 /
- 红色荧光蛋白 /
- 耳蜗圆窗
Abstract: Objective:To construct the recombinant adenovirus vector carrying neurotrophin-3 (NT-3) gene.Methods:NT-3 and DsRed2 (including the ligation region pIRES2) fragment which had been digested by proper enzyme from NT-3-pIRES2-DsRed2 plasmid were cloned into adenovirus pAdShuttle-CMV plasmid.Adenovirus vector pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2 were electroporated into BJ5183 which had been transformed into pAdEasy-1 previously to have the recombination with pAdEasy-1.Recombinant AdEasy plasmid DNA was analyzed and linearized by PacⅠ,then transfected into 293A cells with liposome method.The adenovirus that expressed NT-3 ptotein and red fluorescence was successfully constructed.The adenovirus was amplified in 293A cells three times,and high quality adenovirus was obtained by cesium chloride density gradient centrifugation.Western blot confirmed the expresseion of the NT-3 protein in 293T cells.Results:With the system of Adshuttle,a recombinant adenovirus expressing NT-3 protein and red fluorescence was successfully constructed.Conclusions:The recombinant adenovirus carrying NT-3 gene can be constructed with the system of Adeasy.
- recombinant adenovirus,human /
- neurotrophin-3 /
- red flurorescence protein /
- cochlea round window

[1]	陈传好 , 陈昌杰 , 赵莉 . 人神经营养素-3全长基因克隆及序列分析. 蚌埠医学院学报, 2005, 30(1): 9-11.
[2]	蒋锋 , 胡萍萍 , 沈丽萍 , 吴晓红 , 杨平 . 细胞外基质支架对大鼠嗅鞘细胞神经营养素表达的影响. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(11): 1087-1090.
[3]	李秀义 , 高冬梅 , 温和 . 存活蛋白重组腺病毒载体感染的树突细胞对体外淋巴瘤细胞生长的影响. 蚌埠医学院学报, 2013, 37(11): 1399-1401.
[4]	房兵 , 孙淼 , 李友建 , 武晓茜 , 耿家珍 , 邵先安 . 人-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(5): 500-504.
[5]	张韵秋 , 孙清 , 莫广菊 , 高田静 , 韩思悦 , 谢虹 , 张敏 , 刘华青 . 一种成年人营养素养测量量表的编制及信效度评价. 蚌埠医学院学报, 2021, 46(6): 812-816. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2021.06.026
[6]	陈传好 , 赵莉 , 单增强 , 王小标 . 胶质细胞源性神经营养因子基因真核荧光表达载体的构建. 蚌埠医学院学报, 2006, 31(2): 119-121.
[7]	王凤超 , 朱安友 , 葛鑫 , 胡建国 , 柏平 . 老年人梅毒筛查阳性与荧光梅毒螺旋体抗体吸收法及蛋白质印迹法复测结果的对比分析. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(5): 599-601.
[8]	钟辉 , 刘锦钰 , 龙璐雯 . 人乳头状瘤病毒和EB病毒在子宫颈上皮内瘤变中的表达. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(7): 765-768.
[9]	程阔菊 , 吴庆 , 罗健华 , 魏谭军 , 周殿儒 , 肖成 , 黄河 , 罗云 , 王毅 . 大鼠carabin腺病毒干扰载体构建及功能鉴定. 蚌埠医学院学报, 2021, 46(3): 291-294. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2021.03.003
[10]	汪承虎 . 尖锐湿疣患者人乳头状瘤病毒感染检测. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(2): 178-180.
[11]	孟凡祥 . 尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒的检测与分型. 蚌埠医学院学报, 2013, 37(11): 1475-1476.
[12]	马贵凤 . 滁州地区女性人乳头瘤病毒感染状况及基因亚型分析. 蚌埠医学院学报, 2015, 40(10): 1395-1398.
[13]	王露 , 李见 , 翟玮玮 , 李玉云 . 人凋亡相关因子基因RNA干扰慢病毒载体的构建与包装. 蚌埠医学院学报, 2015, 40(1): 7-10. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2015.01.003
[14]	金龙妹 , 张晓华 , 肖丽萍 , 张琳琳 , 杨慧宾 , 张蕾 . 116 441例普查妇女宫颈人乳头瘤病毒基因分型情况分析. 蚌埠医学院学报, 2018, 43(4): 462-467. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2018.04.011
[15]	王希 . 人乳头瘤病毒感染与阴道微生态、炎症反应的关系分析. 蚌埠医学院学报, 2020, 45(1): 102-105. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2020.01.026
[16]	吕静竹 , 李月琴 , 周天鸿 . RNase P体外靶定切割人巨细胞病毒UL54 mRNA片段研究. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(6): 552-554.
[17]	靳丽杰 , 凌斌 . 子宫颈癌高危型人乳头瘤病毒16/18的表达及其临床意义. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(10): 1064-1066.
[18]	姜盛 , 李建名 , 张星 , 吴炜 , 杨雪萍 . 吉林、兰州地区婴幼儿人星状病毒腹泻的分子流行病学研究. 蚌埠医学院学报, 2013, 37(5): 607-609.
[19]	张林 , 朱勇 , 仲宁 , 吴广洲 , 沈振亚 , 施舜缤 . 人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响. 蚌埠医学院学报, 2016, 41(11): 1417-1421. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.11.005
[20]	木朝宇 , 张晓梅 , 徐珍 , 范德胜 , 刘培明 , 姚慧琳 . 淮北市人乳头状瘤病毒感染及其亚型分布特点. 蚌埠医学院学报, 2022, 47(11): 1576-1579. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2022.11.024

点击查看大图

计量

文章访问数: 3269
HTML全文浏览量: 200
PDF下载量: 13
被引次数: 0

携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定

通讯作者: 高下, xiagao213@yahoocom.cn;

作者简介: 范迟(1983-),男,硕士研究生.

1. 东南大学医学院, 江苏南京 210009;
2. 南京大学医学院附属鼓楼医院耳鼻喉科, 江苏南京 210008

收稿日期: 2009-03-23

基金项目: 江苏省重点人才项目基金资助(RC2007010)南京市医学科技重点项目基金资助(ZKX06019)

关键词:

摘要: 目的:构建含人神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒载体,为初步研究NT-3的在体功能做准备。方法:酶切法从已构建好的真核表达载体NT-3-pIRES2-DsRed2质粒中切下含有NT-3和DsRed2(包括连接区域pIRES2)的目的片段,将其插入到腺病毒骨架质粒pAdShuttle-CMV的多克隆位点中,电穿孔法将腺病毒骨架载体pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2和预转入人肠杆菌BJ5183的穿梭载体pAdEasy-1进行细菌内同源重组。PacⅠ酶切线性化鉴定正确的同源重组载体,脂质体法转染293T细胞,包装形成表达NT-3目的蛋白和红色荧光的腺病毒。通过293T细胞3轮扩增病毒,氯化铯密度梯度离心,获得高滴度的纯化腺病毒。Western blot方法检测蛋白表达情况。结果:同源重组质粒载体的DNA测序证实腺病毒载体中含有NT-3的目的片段,Western blot证实感染重组腺病毒的293T细胞中有相应的NT-3蛋白表达;病毒滴度为10⁹PFU/ml。结论:利用细菌内同源重组的方法可以成功构建同时表达NT-3蛋白和红色荧光的重组腺病毒。