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人乳头瘤病毒(HPV)是功能基因E1-E7及结构基因L1、L2共同组成的嗜上皮性双链脱氧核糖核酸(dsDNA)，多为一过性感染现象，但仍有10%女性可持续感染，且HPV持续感染不仅是宫颈病变的重要危险因素，也是导致宫颈癌的主要病因之一[1-2]。阴道微生态系统则在生殖道感染、尿道感染的预防中扮演重要角色，其具有动态变化特征，并受年龄、经期时长、性交频率等多因素影响。阴道微生物不仅可执行生理功能，亦可抵御明显病原菌或抑制潜在病原菌上，一旦菌群结构失衡，则可增加生物个体感染各种疾病的风险[3-4]。同时，有研究[5-6]报道，当局部微环境中炎症因子发生异常改变，Th1/Th2平衡被打破，并向Th2漂移，则可引起机体免疫应答紊乱，增加患病风险。当前研究HPV感染、阴道微生态、炎症反应的临床报道虽并不少见，但多基于宫颈病变基础，且诊断方式、所选取指标内容繁杂不一、研究对象各异，仍有待持续补充及完善。鉴于此，本研究采集病例，并着重分析HPV感染与阴道微生态、炎症反应的关系，旨在进一步补充及完善其与阴道微生态、炎症反应的关系，为HPV的临床防治提供参考意见，现作报道。
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纳入标准：(1)性生活规律；(2)月经规律，经期持续时间为5~7 d；(3)入组前1周内无抗生素使用史；(4)样本采集前3 d内无性生活史；(5)无阴道灌洗史；(6)无阴道用药史；(7)入院后均行HPV、宫颈液基细胞学及阴道微生态检测；(8)知晓研究内容并自愿签署研究知情同意书。排除标准：(1)合并糖尿病或高血压疾病；(2)系统性红斑狼疮病人；(3)风湿性免疫疾病病人；(4)正在行宫颈病变治疗病人；(5)全子宫切除病人；(6)妊娠期、哺乳期女性；(7)合并宫颈癌前病变或宫颈癌病人。
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按上述纳入与排除标准将2014年1月至2018年2月于我院确诊为HPV感染且宫颈液基细胞学阴性病人182例设为HPV感染组，年龄20~48岁，首次性生活年龄18~25岁；另将同期于我院行健康体检或孕前检查，HPV及宫颈液基细胞学阴性的160名女性设为对照组，年龄19~49岁，首次性生活年龄18~24岁；2组年龄、首次性生活年龄具有可比性。
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(1) HPV检验：应用样本刷在子宫颈、外口顺时针旋转5圈收集子宫颈脱落细胞，并置入保存液，13 000 r/min离心10 min后弃上清液，再加入50 μL裂解液后100 ℃下加热15 min，13 000 r/min离心10 min后留取上清液；依次PCR扩增、杂交、洗膜、显色，依据对照膜条在PC位置上的显色判定结果，蓝色提示杂交显色正常，斑点显现位置即为HPV亚型。(2)阴道微生态检测：应用无菌棉拭子留取阴道侧壁上1/3分泌物，第一根棉拭子用pH精密试纸检测(奥克，pH>4.5即诊断为pH值升高)，0.9%氯化钠溶液分泌物置于玻片上，400倍镜下观察阴道假丝酵母菌病(VVC)、需氧菌性阴道炎(AV；参照Donders诊断表，评分≥3分即诊断为AV阳性)、白细胞(WBC；>10个/HPF即可诊断为阴道炎症)及乳杆菌(Ⅱb、Ⅲ即定义为乳杆菌减少)；第二根棉拭子涂片，1 000倍镜下观察VVC(结合10%KOH湿片，发生芽生孢子或假菌丝即诊断为VVC阳性)、细菌性阴道病(BV；Nugent≥7分为BV阳性)。(3)炎症反应：暴露宫颈口后应用5 mL灭菌0.9%氯化钠溶液冲洗宫颈口及宫颈表面，后穹隆吸出4 mL灌洗液，混匀后装入1.5 mL无菌EP管，3 000 r/min 4 ℃条件下离心5 min；取上清液分装后-80 ℃保存，ELISA双抗体夹心法检测上清液中细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-10水平，并计算IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4比值；其中ELISA试剂盒购自欣博盛(深圳)，酶标检测仪检测各孔相对应OD450值；将每个标准品及标本的OD值-空白孔OD值，按不同浓度标准品所对应的OD450为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线并求出相应位置样本中细胞因子含量。
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采用t(或t′)检验、χ2检验和logistic回归分析。
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2组WBC>10个/HPF比例差异无统计学意义(P>0.05)；但HPV感染组中BV、VVC及AV阳性、pH>4.5、乳杆菌减少率均高于对照组(P < 0.05~P < 0.01)(见表 1)。
阴道微生态 n HPV感染组(n=182) 对照组(n=160) χ2 P BV 阴性 280 139 141 7.92 < 0.01 阳性 62 43 19 VVC 阴性 87 66 21 24.03 < 0.01 阴性阳性 255 116 139 AV 阴性 314 161 153 5.81 < 0.05 阴性阳性 28 21 7 WBC >10个/HPF 290 151 139 1.01 >0.05 ≤10个/HPF 53 31 21 pH >4.5 ≤4.5 62 55 7 38.32 < 0.01 ≤4.5 280 127 153 乳杆菌 正常 301 149 152 13.92 < 0.01 减少 41 33 8 表 1 阴道微生态异常情况在2组中比较(n)
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2组TNF-α、IL-6、IL-10比较差异无统计学意义(P>0.05)；但HPV感染组IL-2、IFN-γ、IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4均低于对照组，IL-4高于对照组(P < 0.01)(见表 2)。
分组 n IL-2 IL-4 IFN-γ IFN-γ/IL-4 IL-2/IL-4 TNF-α IL-6 IL-10 HPV感染组 182 145.87±17.79 34.14±4.86 44.56±5.72 1.30±0.49 3.95±0.97 48.07±6.95 2.71±1.04 13.52±3.05 对照组 160 166.75±12.87 24.59±3.99 58.93±7.23 2.39±0.57 6.78±1.14 47.84±7.30 2.78±0.96 13.99±2.05 t — 12.29* 19.70* 20.49* 19.02* 24.80* 0.30 0.64 1.65 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 >0.05 >0.05 >0.05 *示t′值 表 2 2组炎症反应指标比较(x±s；ng/L)
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将HPV感染、阴道微生态及炎症反应指标分别赋值，HPV感染为因变量(阳性=0、阴性=1)，BV(阳性=0、阴性=1)、VVC(阳性=0、阴性=1)、AV(阳性=0、阴性=1)、pH值(>4.5=0、≤4.5=1)、乳杆菌(减少=0、正常=1)、IL-2(与对照组均值95%CI范围内特定值为参考，低于参考值=0，高于参考值=1)、IL-4(低于参考值=0，高于参考值=1)、IFN-γ(低于参考值=0，高于参考值=1)、IFN-γ/IL-4(低于参考值=0，高于参考值=1)、IL-2/IL-4(低于参考值=0，高于参考值=1)，经logistic回归分析，BV、VVC、AV、pH值、乳杆菌、IL-2、IFN-γ、IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4均与HPV感染密切相关(P < 0.05~P < 0.01)(见表 3)。
自变量 β SE Waldχ2 OR 95%CI P BV 0.96 0.27 12.44 2.60 1.529~4.425 < 0.01 VVC 1.02 0.30 11.34 2.77 1.530~4.997 < 0.01 AV 1.01 0.49 4.35 2.75 1.063~7.118 < 0.05 pH值 0.55 0.27 4.18 1.74 1.023~2.960 < 0.05 乳杆菌 1.37 0.59 5.46 3.94 1.247~2.448 < 0.05 IL-2 1.46 0.58 6.24 4.30 1.369~13.513 < 0.05 IL-4 2.01 0.87 5.30 7.48 1.348~41.473 < 0.05 IFN-γ 1.99 0.71 7.79 7.34 1.810~29.738 < 0.01 IFN-γ/IL-4 1.85 0.67 7.68 6.39 1.721~23.694 < 0.01 IL-2/IL-4 1.58 0.49 10.26 4.87 1.847~12.810 < 0.01 表 3 HPV感染与阴道微生态、炎症反应的logistic回归分析
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本研究显示，2组阴道微生态指标中WBC>10个/HPF比例差异无统计学意义；但HPV组中BV、VVC及AV阳性、pH值>4.5、乳杆菌减少比例均显著低于对照组；且进一步logistic回归分析，BV、VVC、AV、pH值、乳杆菌均是HPV感染的独立影响因素。其中BV、VVC与HPV感染的临床报道较多，如孟龄婷等[7-8]报道，BV、VVC与HPV感染密切相关，本研究结论均与之一致；分析或与BV、VVC病人乳杆菌下降，普雷沃菌、人形支原体等增加后导致HPV感染风险更高有关。也有部分研究结论认为，VVC系过敏反应的一种，其虽可引起局部血管扩张，增加血管通透性并引发炎症反应，但对阴道菌群无明显破坏作用，因此，VVC与HPV感染的关系仍有待持续补充及完善[9-10]。
同时，夏玉洁等[11]报道HPV组中AV阳性比例高达75.0%，提示AV亦是HPV感染的重要影响因素，本研究结论与之相一致，分析或因AV感染引起中重度炎症反应后，受慢性炎症刺激影响，机体自然免疫反应机制被抑制，故具更高的感染风险；潘颖等[12]则报道，HPV病人阴道菌群中乳杆菌明显减少，亦与本研究结论相一致；究其原因，正常情况下，阴道微生物中，乳杆菌占优势地位，其系维持阴道生态平衡、抑制病原微生物生长、增强阴道局部抗感染能力及抗肿瘤能力的重要菌落，一旦乳杆菌减少，其便难以发挥对应生理功能。而pH作为评价阴道微生态的综合评价指标，一般正常女性阴道pH值维持在3.8~4.5之间，一旦宿主机体状态发生变化，阴道内乳杆菌减少便可直接影响乳酸分泌，导致pH值异常上升，而pH值上升又进一步加重阴道微生态紊乱，并增加HPV感染风险，这与韩一栩等[13]的报道结论相一致，均提示阴道pH值与HPV感染密切相关；温先勇等[14]采集617例HPV感染者进行研究后亦指出，阴道酸碱度是影响HPV感染率的重要因素。
本研究还显示，2组TNF-α、IL-6、IL-10比较差异无统计学意义；但HPV感染组IL-2、IFN-γ、IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4显著低于对照组，IL-4高于对照组，进一步logistic回归分析显示，HPV感染与IL-2、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4密切相关。其中IL-2作为免疫应答及免疫调节的核心因子，直接影响免疫细胞功能及宫颈局部免疫状态，并可增强巨噬细胞杀伤肿瘤的活性；IFN-γ则由活化的TH、NK细胞产生，主要发挥免疫调节作用，是促进Th1细胞发育、抑制Th2细胞活性及增殖的重要细胞因子；IL-4则主要由激活的Th2细胞分泌，可促进Th细胞向Th2细胞分化，并抑制其向Th1细胞分化；正常情况下，Th1、Th2细胞相互拮抗维持平衡，一旦其向Th2偏移，即可引起机体免疫应答紊乱，增加HPV感染风险[15-16]。
综上所述，HPV感染与阴道微环境、炎症反应具一定关联性，积极纠正阴道微环境紊乱，改善局部炎症反应，或可降低HPV感染风险。
人乳头瘤病毒感染与阴道微生态、炎症反应的关系分析
Analysis of the relationship between human papillomavirus infection, and vaginal microecology and inflammatory response
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摘要:
目的分析人乳头瘤病毒（HPV）感染与阴道微生态、炎症反应的关系。 方法将确诊为HPV感染且宫颈液基细胞学阴性的182例病人设为HPV感染组；另选取同期行健康体检或孕前检查，并显示HPV及宫颈液基细胞学阴性的160名女性设为对照组，对比2组阴道微生态、炎症反应，logistic回归分析HPV感染与阴道微生态、炎症反应的关系。 结果2组中白细胞>10个/HPF比例及肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6（IL-6）、IL-10水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；但HPV感染组中细菌性阴道病、阴道假丝酵母菌病及需氧菌性阴道炎阳性、pH值>4.5、乳杆菌减少比例及IL-4水平均高于对照组（P < 0.05~P < 0.01）；IL-2、γ-干扰素（IFN-γ）、IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4均低于对照组（P < 0.05~P < 0.01）；logistic回归分析，细菌性阴道病、阴道假丝酵母菌病及需氧菌性阴道炎、pH值、乳杆菌、IL-2、IFN-γ、IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4均与HPV感染密切相关（P < 0.05~P < 0.01）。 结论HPV感染与阴道微生态、炎症反应密切相关，应引起临床重视。 Abstract:ObjectiveTo analyze the relationship between human papillomavirus (HPV) infection, and vaginal microecology and inflammatory reaction. MethodsOne hudred and eighty-two patients with HPV infection complicated with negative cervical cytology and 160 patients with negative HPV complicated with negative cervical cytology were divided into the infection group and control group, respectively.The vaginal microecology and inflammatory response were compared between two groups.The relationship between HPV infection, and vaginal microecology and inflammatory response was analyzed using logistic regression analysis. ResultsThe differences of the proportion of leukocytes >10/HPF, and levels of tumor necrosis factor-α, interleukin-6 (IL-6) and IL-10 between two groups were not statistically significant (P>0.05).The bacterial vaginosis, vaginal candidiasis, positive aerobic vaginitis, pH>4.5, lactobacillus reduction ratio and IL-4 level in infection group were higher than those in control group (P < 0.05 to P < 0.01).The levels of IL -2, IFN-γ, IFN-γ/IL-4 and IL-2/IL-4 in infection group were lower than those in control group (P < 0.05 to P < 0.01).The results of logistic regression analysis showed that the bacterial vaginal disease, vaginal candidiasis and aerobic vaginitis, pH, lactobacilli, IL-2, IFN-γ, IFN-γ/IL-4, IL-2/IL-4 were closely related to the HPV infection (P < 0.05 to P < 0.01). ConclusionsThe HPV infection is closely related to vaginal microecology and inflammatory reaction, which should be clinically paid attention to. -
表 1 阴道微生态异常情况在2组中比较(n)
阴道微生态 n HPV感染组(n=182) 对照组(n=160) χ2 P BV 阴性 280 139 141 7.92 < 0.01 阳性 62 43 19 VVC 阴性 87 66 21 24.03 < 0.01 阴性阳性 255 116 139 AV 阴性 314 161 153 5.81 < 0.05 阴性阳性 28 21 7 WBC >10个/HPF 290 151 139 1.01 >0.05 ≤10个/HPF 53 31 21 pH >4.5 ≤4.5 62 55 7 38.32 < 0.01 ≤4.5 280 127 153 乳杆菌 正常 301 149 152 13.92 < 0.01 减少 41 33 8 
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表 2 2组炎症反应指标比较(x±s；ng/L)
分组 n IL-2 IL-4 IFN-γ IFN-γ/IL-4 IL-2/IL-4 TNF-α IL-6 IL-10 HPV感染组 182 145.87±17.79 34.14±4.86 44.56±5.72 1.30±0.49 3.95±0.97 48.07±6.95 2.71±1.04 13.52±3.05 对照组 160 166.75±12.87 24.59±3.99 58.93±7.23 2.39±0.57 6.78±1.14 47.84±7.30 2.78±0.96 13.99±2.05 t — 12.29* 19.70* 20.49* 19.02* 24.80* 0.30 0.64 1.65 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 >0.05 >0.05 >0.05 *示t′值
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表 3 HPV感染与阴道微生态、炎症反应的logistic回归分析
自变量 β SE Waldχ2 OR 95%CI P BV 0.96 0.27 12.44 2.60 1.529~4.425 < 0.01 VVC 1.02 0.30 11.34 2.77 1.530~4.997 < 0.01 AV 1.01 0.49 4.35 2.75 1.063~7.118 < 0.05 pH值 0.55 0.27 4.18 1.74 1.023~2.960 < 0.05 乳杆菌 1.37 0.59 5.46 3.94 1.247~2.448 < 0.05 IL-2 1.46 0.58 6.24 4.30 1.369~13.513 < 0.05 IL-4 2.01 0.87 5.30 7.48 1.348~41.473 < 0.05 IFN-γ 1.99 0.71 7.79 7.34 1.810~29.738 < 0.01 IFN-γ/IL-4 1.85 0.67 7.68 6.39 1.721~23.694 < 0.01 IL-2/IL-4 1.58 0.49 10.26 4.87 1.847~12.810 < 0.01
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