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2型糖尿病病人因为体内血糖长期升高，常伴有肾脏微血管病变。由于肾脏有强大的代偿功能，糖尿病肾病发病早期临床症状不明显，因此临床需要能早期监测糖尿病病人肾小球、肾小管损伤的标志物。目前有较多报道[1~4]尿液中外泌体内二肽基肽酶-4(exosomal dipeptidyl peptidase 4, DPP-4)是肾损伤的敏感标志物之一，本研究将探讨尿DPP-4与胱抑素C(cystatin C, CysC)以及α1-微球蛋白(α1-microglobulin, α1-MG)、免疫球蛋白(immunoglobulin G, IgG)、尿转铁蛋白(urine transferrin, TRU)等糖尿病肾病传统检测指标间的相关性，研究尿外泌体DPP-4联合尿CysC、尿α1-MG和TRU检测是否能早期诊断糖尿病病人早期肾脏损伤。现作报道。
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依据尿液中白蛋白和尿肌酐比值(UACR)参考值范围：正常蛋白尿 < 30 mg/g CR；微量蛋白尿30~300 mg/g CR；大量蛋白尿>300 mg/g CR，选取2018年9月至2020年5月在我院肾脏病科和内分泌科住院的2型糖尿病病人120例，分为3组：正常蛋白尿组、微量蛋白尿组、大量蛋白尿组，各40例。对照组随机选择40名同一时期在我院体检中心及门诊正常体检的人员。排除标准：所有入选病例均排除肾移植、恶性肿瘤、各种炎症以及糖尿病病人伴严重心、肝功能不全等疾病。
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留取10 mL 2型糖尿病病人早晨第一次尿液。采用西班牙博士泰公司尿液特种蛋白分析仪(A25)及配套试剂、校准品检测尿白蛋白、α1-MG、CysC、TRU、IgG，检测时所有检测指标室内质控均在控。
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尿液外泌体中的DPP-4提取用systembio公司ExoQuick-TCTM Exosome提取试剂盒，试剂盒的批号：281122-105。ELISA方法检测尿外泌体DPP-4，检测试剂盒购自R&D Systems，试剂盒的批号：931128，所有操作及检测步骤均严格遵守检测试剂盒所附的操作说明书，最终用酶标仪450 nm波长检测吸光度值，并根据标准品计算浓度[5]。
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采用非参数秩和Kruskal-Wallis检验、Pearson相关性分析和受试者工作特征曲线(ROC)。
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组间比较显示，尿液外泌体中的DPP-4与α1-MG水平为对照组 < 正常蛋白尿组 < 微量蛋白尿组 < 大量蛋白尿组(P＜0.05~P＜0.01)，CysC、TRU、IgG水平为对照组、正常蛋白尿组 < 微量蛋白尿组 < 大量蛋白尿组(P＜0.05~P＜0.01)(见表 1)。
分组 n DPP-4/(pg/mL) α1-MG/(mg/L) TRU/(mg/L) IgG/(mg/L) CysC/(mg/L) 对照组 40 3.59±0.48 4.19±154 0.51±0.12 2.08±1.41 0.12±0.19 正常蛋白尿组 40 4.79±1.25* 15.87±11.79* 0.75±0.87 2.92±2.07 0.13±0.21 微量蛋白尿组 40 5.77±1.22△* 26.17±21.99△* 10.4±17.44△* 15.08±18.48△* 0.22±0.85△* 大量蛋白尿组 40 7.65±2.38**△# 50.76±42.15**△# 56.3±38.92**△# 96.34±95.89**△# 0.56±0.67**△# Z — 129.24 120.69 234.43 202.52 181.07 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 t检验：与对照组比较*P＜0.05，** P＜0.01；与正常蛋白尿组比较△P＜0.05；与微量蛋白尿比较#P＜0.05 表 1 各组尿液中的外泌体DPP-4、α1-MG、CysC、TRU、IgG水平比较(x±s)
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尿外泌体DPP-4与α1-MG、CysC、TRU、IgG呈正相关(r值分别为0.771、0.789、0.605、0.509，P＜0.05)(见表 2)。
α1-MG CysC TRU IgG CysC 0.196* TRU 0.572* 0.207* IgG 0.575* 0.143* 0.860* DDP-4 0.771* 0.789* 0.605* 0.509* *P＜0.05 表 2 糖尿病病人、对照组各检测指标相关性分析
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DPP-4、α1-MG、CysC、TRU、IgG以及DPP-4与α1-MG、CysC、TRU联合检测水平的ROC曲线下面积：0.742、0.736、0.843、0.868、0.836和0.899；DPP-4、α1-MG、CysC、TRU联合检测灵敏度为93.42%，特异度为86.90%，阳性预测值为86.59%，阴性预测值为93.59%(见图 1)。
图 1 尿液中外泌体DPP-4、α1-MG、CysC、TRU、IgG以及联合检测对糖尿病肾病诊断的ROC曲线
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糖尿病病人在高血糖等一系列因素长期作用下致使肾脏微血管病变并导致肾小球硬化，同时也有研究结果显示肾小球病变的同时肾小管也发生病变，因此需要早期监测肾小球和肾小管功能[5-7]。目前临床上除检测血尿素、肌酐等血液指标外，还常检测尿液中微量白蛋白、α1-MG、TRU、IgG等指标的含量来反映尿蛋白排泄情况，但这些指标不能反映更早期的肾脏病变。
DPP-4在人体内其主要生理功能是水解多肽，其相对分子量为11 000，存在于血浆、脑脊液、尿液等体液中[8]。人体尿液中的外泌体蛋白水平约占尿液中总蛋白水平的3%，尿外泌体DPP-4可间接导致肾脏系膜细胞增长、并致使系膜外基质产生大量沉积，从而导致肾小球基底膜厚度增加，肾小球发生病变。在前期研究[8]中，结果显示随着尿液中白蛋白含量的增多，尿液中外泌体DPP-4含量也相应增高，研究结果表明尿液中外泌体DPP-4含量与血液中的CysC含量有较强的正相关关系。本研究结果显示在正常蛋白尿时，2型糖尿病病人尿液中的外泌体DPP-4已开始升高(P＜0.05)。表明尿液中的外泌体DPP-4水平能反映肾小球的较早病变，可作为2型糖尿病病人肾脏早期病变的检测标志物。同时尿外泌体DPP-4在微量蛋白尿和大量蛋白尿组也显著升高，两两比较差异有统计学意义(P＜0.05~P＜0.01)，可作为2型糖尿病病人肾脏病变和病情变化的良好评价指标。
α1-MG是反映肾小管早期损伤的有效指标[9]，本研究检测结果显示，α1-MG在正常蛋白尿组就升高且各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05~P＜0.01)，表明在2型糖尿病病人肾脏病变早期肾小管就有损伤。血CysC监测早期肾功能损伤，比传统血清尿素、肌酐有更高的敏感度和特异度，对于评价肾小球滤过率有非常重要的临床价值[10-13]。目前有研究[14]报道尿CysC含量在2型糖尿病病人肾脏病变早期就开始增加，检测尿CysC水平对2型糖尿病病人早期肾脏变病具有一定的临床意义。本研究进一步直接检测尿CysC、TRU、IgG在糖尿病病人不同尿蛋白组的含量，结果表明CysC、TRU、IgG水平在正常蛋白尿组就升高，但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，在微量蛋白尿组、大量蛋白尿组均明显比对照组高(P＜0.05)。说明CysC、TRU在2型糖尿病病人早期就开始增加，可以早期肾脏病变检测的一个良好标志物。由于IgG是大分子蛋白，肾小球损伤严重时才在尿液中出现，但在本研究中发现尿IgG在微量蛋白尿组就开始升高，且数据呈非正态分布，有可能是样本量较小造成的偏差。因此在本研究中，我们仅选择DPP-4、α1-MG、CysC、TRU四项指标联合检测在糖尿病肾病早期的诊断作用。本研究结果表明，DPP-4、α1-MG、CysC、TRU、IgG以及DPP-4与α1-MG、CysC、TRU联合检测的ROC曲线下面积为0.742、0.736、0.843、0.868、0.836和0.899；DPP-4、α1-MG、CysC、TRU联合检测灵敏度为灵敏度为93.42%，特异度为86.90%，阳性预测值为86.59%，阴性预测值为93.59%。说明尿外泌体DPP-4联合尿α1-MG、尿CysC、TRU检测有较高的灵敏度和特异度，能全面反映肾小球和肾小管早期损伤，优于单个指标检测。
综上所述，尿液中的外泌体DPP-4联合尿α1-MG、尿CysC、TRU检测对糖尿病病人早期肾小球和肾小管损伤的预测价值较高，但由于本研究样本量相对较少，且部分数据为非正态分布，因此该四项联合检测指标作为糖尿病肾病病情变化的检测指标还需要进一步研究。由于尿液检测属于无创检测，尿液标本容易获取，病人依存性较好，所以尿液中的外泌体DPP-4联合尿CysC、尿α1-MG和TRU检测，是一种简单、快捷的无创性早期检测新技术，可以诊断糖尿病肾病早期肾脏病变，适合在临床推广。
糖尿病肾病病人尿外泌体DPP-4、Cys C、α1-MG和转铁蛋白联合检测的临床价值
Clinical value of the combined detection of urinary exosome DPP-4, Cys C, α1-MG and transferrin in patients with diabetic nephropathy
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摘要:
目的探讨糖尿病肾病病人尿外泌体二肽基肽酶-4（exosome-DPP-4）、胱抑素C（Cys C）、α1-微球蛋白（α1-MG）和尿转铁蛋白（TRU）联合检测的临床价值。 方法检测40例健康对照组和120例糖尿病病人[正常蛋白尿组（40例）、微量蛋白尿组（40例）和大量蛋白尿组（40例）]尿外泌体DPP-4和尿Cys C、α1-MG、TRU、IgG、微量白蛋白水平，应用Pearson相关分析评价各项目间的相关性，采用受试者工作特征曲线评估DPP-4、Cys C、α1-MG、TRU、IgG等诊断糖尿病肾病的价值。 结果糖尿病肾病病人尿液外泌体中的DPP-4、尿α1-MG含量高于对照组（P＜0.05），且随着尿蛋白含量的增加而上升（P＜0.05~P＜0.01）；Cys C、TRU、IgG水平在正常蛋白尿组与对照组差异无统计学意义（P>0.05），在微量蛋白尿组、大量蛋白尿组Cys C、TRU、IgG水平均高于对照组（P＜0.05~P＜0.01）。尿外泌体DPP-4与α1-MG、Cys C、TRU、IgG呈正相关关系（P＜0.05）。DPP-4、α1-MG、Cys C、TRU、IgG以及DPP-4与α1-MG、Cys C、TRU联合检测水平的受试者工作特征曲线下面积为0.742、0.736、0.843、0.868、0.836和0.899；DPP-4、α1-MG、Cys C及TRU联合检测灵敏度为93.42%，特异度为86.90%，阳性预测值为86.59%，阴性预测值为93.59%。 结论尿外泌体DPP-4、尿Cys C和尿α1-MG、TRU联合检测对糖尿病肾病的早期诊断具有较高的临床价值。 Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical value of the combined detection of urinary exosome dipeptidyl peptidase 4(DPP-4), α1-microglobulin(α1-MG), cystatin C(Cys C) and transferring(TRU) in patients with diabetic nephropathy. MethodsThe levels of DPP-4, α1-MG, Cys C, TRU, IgG, microalbuminuria in 120 diabetic patients[including normal proteinuria group(40 cases), microalbuminuria group(40 cases) and massive proteinuria group(40 cases)] and healthy control group(40 cases) were detected.The Pearson correlation analysis was used to evaluate the correlation among the items.The receiver operating characteristic curve was used to evaluate the value of DPP-4, Cys C, α1-MG, TRU and IgG in the diagnosis of diabetic nephropathy. ResultsThe contents of DPP-4 and α1-MG in urine exosomes of diabetic nephropathy patients were higher than those in control group(P < 0.05), and increased with the increasig of urine protein content(P < 0.05 to P < 0.01).The differences of the levels of Cys C, TRU and IgG between normal albuminuria group and control group were not statistically significant(P>0.05), and the levels of Cys C, TRU and IgG in microalbuminuria group and massive albuminuria group were higher than those in control group(P < 0.05 to P < 0.01).The urinary exosome DPP-4 was positively correlated with α1-MG, Cys C, TRU and IgG(P < 0.05).The areas under the receiver operating characteristic curve of DPP-4, α1-MG, Cys C, TRU, IgG, and combined DPP-4, α1-MG, Cys C and TRU were 0.742, 0.736, 0.843, 0.868, 0.836 and 0.899, respectively.The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of the combined detection of DPP-4, α1-MG, Cys C and TRU were 93.42%, 86.90%, 86.59% and 93.59%, respectively. ConclusionsThe combined detection of urinary exosome DPP-4, urinary Cys C and urinary α1-MG and TRU has high clinical value in the early diagnosis of diabetic nephropathy. -
Key words:
- diabetic nephropathy /
- cystatin C /
- α1-microglobulin /
- urinary exosome /
- dipeptidyl peptidase 4
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表 1 各组尿液中的外泌体DPP-4、α1-MG、CysC、TRU、IgG水平比较(x±s)
分组 n DPP-4/(pg/mL) α1-MG/(mg/L) TRU/(mg/L) IgG/(mg/L) CysC/(mg/L) 对照组 40 3.59±0.48 4.19±154 0.51±0.12 2.08±1.41 0.12±0.19 正常蛋白尿组 40 4.79±1.25* 15.87±11.79* 0.75±0.87 2.92±2.07 0.13±0.21 微量蛋白尿组 40 5.77±1.22△* 26.17±21.99△* 10.4±17.44△* 15.08±18.48△* 0.22±0.85△* 大量蛋白尿组 40 7.65±2.38**△# 50.76±42.15**△# 56.3±38.92**△# 96.34±95.89**△# 0.56±0.67**△# Z — 129.24 120.69 234.43 202.52 181.07 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 t检验：与对照组比较*P＜0.05，** P＜0.01；与正常蛋白尿组比较△P＜0.05；与微量蛋白尿比较#P＜0.05 
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表 2 糖尿病病人、对照组各检测指标相关性分析
α1-MG CysC TRU IgG CysC 0.196* TRU 0.572* 0.207* IgG 0.575* 0.143* 0.860* DDP-4 0.771* 0.789* 0.605* 0.509* *P＜0.05
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