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卵巢癌是全球第二致命的妇科恶性肿瘤,也是导致女性癌症相关死亡的第七大常见原因[1]。由于其发病隐匿,且缺乏有效可靠的诊断方法,大多数卵巢癌病人发展到晚期时才被发现,并且在原发性细胞减灭术和标准的一线化疗后再次发现病灶[2]。尽管治疗手段在不断的改进和更新,但卵巢癌病人的生存率仍没有明显的提高[3],所以需要探索更加有效的新的治疗方法。中医中药在医疗保健系统中发挥重要作用,从中药中筛选开发抗肿瘤新药是非常好的策略。二氢杨梅素存在于多种藤茶植物中,属于黄酮类化合物,文献[4]报道其具有很好的调节血糖和血脂、调理免疫功能、抗氧化、保护肝脏、抗凋亡、抗癌等多方面的药理活性[4]。而二氢杨梅素这些药理作用的机制分别与调节包括葡萄糖代谢和TCA循环在内的24种代谢途径[5]、激活PI3K/Akt/FoxO3a信号通路[6]、调节脂质平衡以及肝细胞的死亡和再生[7]、MAPKs和PI3K/AKT介导的信号通路以及线粒体功能障碍[8]、TFEB通路介导的自噬[9]等有关。另外还发现,二氢杨梅素可通过影响MAPK/ERK通路而下调MAR1 mRNA和P-gp的表达,从而增强阿奇霉素的抗肿瘤作用[10]。这些实验结果均为本研究奠定了基础。本文则主要从对细胞生长、凋亡及信号转导通路方面的影响探究二氢杨梅素对人卵巢癌HO-8910细胞的作用,为进一步开发二氢杨梅素提供依据。
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同时采用MTT和CCK-8法检测二氢杨梅素对HO-8910细胞活性的影响,2种方法检测的二氢杨梅素体外对HO-8910细胞活性的抑制作用趋势一致,均随着药物浓度的增加而增高(P<0.01),各组细胞生长抑制率与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05),因此可见二氢杨梅素体外可抑制HO-8910细胞的生长,并具有浓度依赖性(见表 1~2)。
分组 n OD值(x±s) 抑制率/% 空白对照 6 0.727±0.075 — 二氢杨梅素10 μmol/L 6 0.629±0.064* 13.81 二氢杨梅素20 μmol/L 6 0.514±0.083*# 29.61 二氢杨梅素40 μmol/L 6 0.435±0.073*# 40.41 F — 17.99 — P — <0.01 — MS组内 — 0.005 — q检验:与空白对照组比较*P<0.05;与二氢杨梅素10 μmol/L组比较#P<0.05;与二氢杨梅素20 μmol/L组比较▲P<0.05 表 1 MTT法检测二氢杨梅素对HO-8910细胞增殖的抑制作用
分组 n OD值(x±s) 抑制率/% 空白对照 6 0.742±0.073 — 二氢杨梅素10 μmol/L 6 0.626±0.066* 15.43 二氢杨梅素20 μmol/L 6 0.526±0.084*# 28.99 二氢杨梅素40 μmol/L 6 0.427±0.072*#▲ 42.34 F — 19.95 — P — <0.01 — MS组内 — 0.006 — q检验:与空白对照组比较*P<0.05;与二氢杨梅素10 μmol/L组比较#P<0.05;与二氢杨梅素20 μmol/L组比较▲P<0.05 表 2 CCK-8法检测二氢杨梅素对HO-8910细胞增殖的抑制作用
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流式细胞仪检测10、20、40 μmol/L二氢杨梅素分别与HO-8910细胞共同作用48 h,结果显示,各药物组凋亡率均明显高于空白对照组(P<0.05)。且细胞凋亡率随着二氢杨梅素浓度的升高而增加,具有浓度依赖性(见图 1、表 3)。
分组 n 凋亡率/% 空白对照 3 4.99±0.52 二氢杨梅素10 μmol/L 3 7.86±0.57* 二氢杨梅素20 μmol/L 3 22.61±2.59*# 二氢杨梅素40 μmol/L 3 33.35±3.24*#▲ F — 130.63 P — <0.01 MS组内 — 2.951 q检验:与空白对照组比较*P<0.05;与二氢杨梅素10 μmol/L组比较#P<0.05;与二氢杨梅素20 μmol/L组比较▲P<0.05 表 3 二氢杨梅素对HO-8910细胞凋亡的影响(x±s)
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不同浓度的二氢杨梅素与HO-8910细胞共同作用48 h后,荧光显微镜下可观察到细胞出现明显的凋亡特征,细胞体积缩小,细胞质逐渐浓缩,并发出明亮蓝色荧光,这种变化随着药物浓度的增加愈发明显;而空白对照组细胞则排列整齐,大小均一,表现为均匀的蓝色(见图 2)。
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Western blotting结果显示,与空白对照组相比,二氢杨梅素作用于HO-8910细胞后,随浓度的增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐降低,促凋亡蛋白Bax和caspase-3表达则逐渐升高,差异具有统计学意义(P<0.05)(见图 3、表 4)。
分组 n Caspase-3 Bax Bcl-2 空白对照 3 0.73±0.21 0.42±0.11 1.33±0.09 二氢杨梅素10 μmol/L 3 1.33±0.11* 0.73±0.15* 0.94±0.15* 二氢杨梅素20 μmol/L 3 1.71±0.08*# 0.91±0.14* 0.84±0.11* 二氢杨梅素40 μmol/L 3 2.20±0.17*#▲ 0.96±0.08* 0.68±0.12* F — 50.52 11.60 16.56 P — <0.01 <0.01 <0.01 MS组内 — 0.023 0.022 0.015 q检验:与空白对照组比较*P<0.05;与10 μmol/L组比较#P<0.05;与20 μmol/L组比较▲P<0.05 表 4 二氢杨梅素对HO-8910细胞凋亡相关蛋白的影响(x±s)
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Western blotting结果显示,与空白对照组比较,二氢杨梅素作用于HO-8910细胞后,通路蛋白ERK、p-ERK的表达显著下调(P<0.05),提示二氢杨梅素可通过抑制MAPK/ERK通路来诱导HO-8910细胞凋亡(见图 4、表 5)。
分组 n ERK p-ERK 空白对照 3 2.19±0.07 2.55±0.14 二氢杨梅素10 μmol/L 3 1.98±0.08* 2.08±0.23* 二氢杨梅素20 μmol/L 3 1.83±0.14* 1.77±0.21* 二氢杨梅素40 μmol/L 3 1.49±0.16*#▲ 0.82±0.18*#▲ F — 17.78 43.02 P — <0.01 <0.01 MS组内 — 0.016 0.045 q检验:与空白对照组比较*P<0.05;与10 μmol/L组比较#P<0.05;与20 μmol/L组比较▲P<0.05 表 5 二氢杨梅素对HO-8910细胞凋亡通路蛋白的影响(x±s)
二氢杨梅素诱导人卵巢癌HO-8910细胞凋亡及机制研究
Study on the apoptosis induced by dihydromyricetin in human ovarian cancer HO-8910 cells and its mechanism
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摘要:
目的二氢杨梅素体外对人卵巢癌HO-8910细胞生长、凋亡的影响,及其作用机制的探讨。 方法体外培养HO-8910细胞,以不同浓度(10、20、40 μmol/L)的二氢杨梅素作用于HO-8910细胞,MTT法及CCK-8法检测对细胞生长的抑制作用;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响;Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡情况;Western blotting法检测Caspase-3、Bcl-2、Bax、ERK、p-ERK蛋白表达情况。 结果MTT和CCK-8结果均显示二氢杨梅素可浓度依赖性地抑制HO-8910细胞的生长;流式细胞仪结果显示二氢杨梅素可浓度依赖性促进HO-8910细胞凋亡;Hoechst 33258荧光染色结果显示,二氢杨梅素作用后的HO-8910细胞呈现典型凋亡形态学改变;Western blotting结果显示二氢杨梅素可上调HO-8910细胞Caspase-3和Bax水平,下调Bcl-2、ERK、p-ERK水平(P < 0.05)。 结论二氢杨梅素具有抗人卵巢癌HO-8910细胞活性的作用,并诱导其凋亡,其作用机制与调控ERK/MAPK信号通路有关。 Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of dihydromyricetin on the growth and apoptosis of human ovarian cancer HO-8910 cells, and its mechanism. MethodsThe HO-8910 cells were cultured in vitro, and treated with dihydromyricetin at different concentrations(10, 20 and 40 μmol/L).The proliferation of cells was detected using MTT and CCK-8 method, the apoptosis of cells was detected using the Annexin V-FITC/PI flow cytometry and Hoechst 33258 fluorescence staining, and the expression levels of Caspase-3, Bcl-2, Bax, ERK and p-ERK protein were detected using Western blotting. ResultsThe results of MTT and CCK-8 was showed that dihydromyricetin could inhibit the growth of HO-8910 cells in a concentration-dependent manner.The results of flow cytometry showed that dihydromyricetin could promote the HO-8910 cell apoptosis in a concentration-dependent manner.The typical morphological changes of apoptosis in HO-8910 cells treated with dihydromyrmectin were found using Hoechst 33258 fluorescence staining.The results of Western blotting showed that dihydromyricetin could up-regulate the levels of Caspase-3 and Bax, and down-regulate the levels of Bcl-2, ERK and p-ERK in HO-8910 cells(P < 0.05). ConclusionsDihydromyricetin can inhibit the activity of human ovarian cancer HO-8910 cells and induce their apoptosis, and the mechanism of which is related to the regulation of ERK/MAPK signaling pathway. -
Key words:
- ovarian neoplasms /
- dihydromyricetin /
- HO-8910 cells /
- proliferation /
- apoptosis
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表 1 MTT法检测二氢杨梅素对HO-8910细胞增殖的抑制作用
分组 n OD值(x±s) 抑制率/% 空白对照 6 0.727±0.075 — 二氢杨梅素10 μmol/L 6 0.629±0.064* 13.81 二氢杨梅素20 μmol/L 6 0.514±0.083*# 29.61 二氢杨梅素40 μmol/L 6 0.435±0.073*# 40.41 F — 17.99 — P — <0.01 — MS组内 — 0.005 — q检验:与空白对照组比较*P<0.05;与二氢杨梅素10 μmol/L组比较#P<0.05;与二氢杨梅素20 μmol/L组比较▲P<0.05 表 2 CCK-8法检测二氢杨梅素对HO-8910细胞增殖的抑制作用
分组 n OD值(x±s) 抑制率/% 空白对照 6 0.742±0.073 — 二氢杨梅素10 μmol/L 6 0.626±0.066* 15.43 二氢杨梅素20 μmol/L 6 0.526±0.084*# 28.99 二氢杨梅素40 μmol/L 6 0.427±0.072*#▲ 42.34 F — 19.95 — P — <0.01 — MS组内 — 0.006 — q检验:与空白对照组比较*P<0.05;与二氢杨梅素10 μmol/L组比较#P<0.05;与二氢杨梅素20 μmol/L组比较▲P<0.05 表 3 二氢杨梅素对HO-8910细胞凋亡的影响(x±s)
分组 n 凋亡率/% 空白对照 3 4.99±0.52 二氢杨梅素10 μmol/L 3 7.86±0.57* 二氢杨梅素20 μmol/L 3 22.61±2.59*# 二氢杨梅素40 μmol/L 3 33.35±3.24*#▲ F — 130.63 P — <0.01 MS组内 — 2.951 q检验:与空白对照组比较*P<0.05;与二氢杨梅素10 μmol/L组比较#P<0.05;与二氢杨梅素20 μmol/L组比较▲P<0.05 表 4 二氢杨梅素对HO-8910细胞凋亡相关蛋白的影响(x±s)
分组 n Caspase-3 Bax Bcl-2 空白对照 3 0.73±0.21 0.42±0.11 1.33±0.09 二氢杨梅素10 μmol/L 3 1.33±0.11* 0.73±0.15* 0.94±0.15* 二氢杨梅素20 μmol/L 3 1.71±0.08*# 0.91±0.14* 0.84±0.11* 二氢杨梅素40 μmol/L 3 2.20±0.17*#▲ 0.96±0.08* 0.68±0.12* F — 50.52 11.60 16.56 P — <0.01 <0.01 <0.01 MS组内 — 0.023 0.022 0.015 q检验:与空白对照组比较*P<0.05;与10 μmol/L组比较#P<0.05;与20 μmol/L组比较▲P<0.05 表 5 二氢杨梅素对HO-8910细胞凋亡通路蛋白的影响(x±s)
分组 n ERK p-ERK 空白对照 3 2.19±0.07 2.55±0.14 二氢杨梅素10 μmol/L 3 1.98±0.08* 2.08±0.23* 二氢杨梅素20 μmol/L 3 1.83±0.14* 1.77±0.21* 二氢杨梅素40 μmol/L 3 1.49±0.16*#▲ 0.82±0.18*#▲ F — 17.78 43.02 P — <0.01 <0.01 MS组内 — 0.016 0.045 q检验:与空白对照组比较*P<0.05;与10 μmol/L组比较#P<0.05;与20 μmol/L组比较▲P<0.05 -
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