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疟疾是危害严重的寄生虫病。据2021年世界卫生组织数据[1]显示，2020年全球疟疾病例2.41亿，较2019年增加1 400万。尽管我国自2017年起已无本土疟疾病例报告，且WHO于2021年6月正式宣布中国消除疟疾[2]，但输入性疟疾及疟疾再传播形势依然严峻[3]。传染病最理想的控制手段是有效的疫苗。尽管疟疾疫苗近年来已取得重大进展，首个疟疾疫苗获批上市，在撒哈拉以南非洲地区和中度至高度恶性疟原虫传播风险地区的儿童中使用[4]，但其保护率仍不理想，约30%[5]。疟疾疫苗研发仍亟需加强。疟原虫的致病仅由红内期疟原虫引起，红外期疟原虫并不致病，因而红外期是预防性疫苗研制的理想阶段。疟原虫减毒子孢子可诱发高效的保护性免疫[6]，但通过物理化学方法制备减毒子孢子不易进行质量控制。因此，遗传减毒子孢子疫苗是较为理想的疟疾预防性疫苗策略[7-8]，即针对疟原虫红外期特异性关键发育基因进行敲除，制备遗传性状稳定的减毒子孢子，子孢子感染宿主后，疟原虫发育停滞于红外期，可诱发机体保护性免疫。疟原虫红外期特异性关键发育基因敲除是制备遗传减毒子孢子疫苗的关键。由于疟原虫基因敲除较困难，故遗传减毒子孢子疫苗发展较为缓慢。随着CRISPR/Cas9技术在疟原虫领域的应用[9-10]，遗传减毒子孢子疫苗迎来新的发展机遇。近年来，部分仅在红外期疟原虫表达的发育关键基因如UIS[11-13]、P36[14]、P52[15]、SAP1[16-17]、Plasmei2[18]、Lisp2[19]等陆续被鉴定，并被应用于疟疾减毒子孢子疫苗研究。
有研究[20]发现疟原虫特异的顶质体蛋白(plasmodium-specific apicoplast protein plays an important role for liver merozoite formation，PALM)在伯氏疟原虫红外期裂殖子形成中起重要作用，其他疟原虫是否具备此特征，尚不清楚。约氏疟原虫是一种疟疾研究中常用鼠疟原虫，目前认为利用其建立的鼠疟模型的免疫特征与人类更加接近，是研究疟疾疫苗的更加理想的实验动物模型。构建PALM基因敲除约氏疟原虫虫株是了解PALM在约氏疟原虫红外期裂殖子形成中是否也具有重要作用，进而利用约氏疟原虫小鼠模型深入研究疟原虫减毒子孢子疫苗的必要前提。因此，本研究拟采用CRISPR/Cas9技术，构建PALM基因敲除的约氏疟原虫株，以期为进一步研究PALM基因功能及基于PALM的遗传减毒子孢子疫苗提供基础。
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非致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XNL)虫株由中国医科大学曹雅明教授馈赠，经本实验室小鼠传代保种。雌性昆明小鼠(5~6周龄)，SPF级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证编号：SCXK(湘)2019-0004]。
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T4连接酶，Golden Gate Enzyme Mix, 限制性内切酶BsaI、BsmBI购自NEB公司，高保真PCR酶Gflex购自日本Takara公司；电转试剂盒P3购自瑞士Lonza公司，无内毒素质粒大提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒及血液基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司；乙胺嘧啶购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
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DH5a感受态细胞购自天根生化科技有限公司，质粒pYCm为厦门大学袁晶教授惠赠，质粒上含乙胺嘧啶和5-氟胞嘧啶抗性基因。本实验室在此基础上进行改造，改建为带有Golden Gate克隆功能和蓝白斑筛选功能的pYCm-golden-blue质粒。
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从疟原虫Plasmo DB数据库中下载P.yoelii 17XNL PALM基因序列，确定敲除区域以及进行同源重组修复的左、右同源臂长度。应用专用网站(
http://crispr.tefor.net/ )设计sgRNA，用NEB Golden Gate组装设计软件(https://goldengate.neb.com/ )设计用于扩增左、右同源臂的上下游引物。 -
从P.yoelii 17XNL野生型(wild type, WT)基因组中扩增PALM左、右同源臂, PCR反应条件：94 ℃ 1 min; 98 ℃ 10 s; 55 ℃ 15 s; 68 ℃ 20 s; 共30个循环；68 ℃ 10 min。BsaI酶切pYCm-golden-blue质粒，切胶纯化PCR产物和载体酶切产物；根据NEB Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HFv2)说明书，用推荐的摩尔比来计算连接反应所需要的DNA量，配置连接反应体系。接下来将连接后产物转化DH5a感受态细胞，筛选阳性重组质粒。将根据P.yoelii PALM基因区域设计的sgRNA退火形成双链。BsmBI酶切pYCm-golden-blue-PALM-LHA-RHA质粒，切胶纯化载体酶切产物，T4连接酶将退火成双链后的sgRNA与切胶纯化产物连接，转化DH5a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性菌落，菌液PCR初步验证，测序确定，最终确保CRISPR工具质粒构建完成。CRISPR工具质粒基因编辑图解及引物设计见图 1。所需PCR引物见表 1(下划线部分为BsaI酶识别点)，以上引物均由上海生工生物公司合成。
图 1 CRISPR工具质粒基因编辑图解
名称 序列 LHA-F GGC TAC GGT CTC GGG AGA TAA GAG AGT CTT TTG TAC AAC LHA-R GGC TAC GGT CTC TTT CAT ATT TTT GCG CAT TTT TTG CCT TGA AGG GTT AAA G RHA-F GGC TAC GGT CTC TTG AAT GCA ACA TTA ATA AAA ATT AAA TAA G RHA-R GGC TAC GGT CTC CAT GGT ATG TCA AAA TTA TGC ATA AAT ATA TTG sgRNA Fw GAT GAT AAT AGT AGA AAC GGA sgRNA Rv TCC GTT TCT ACT ATT ATC ATC P1 GCG AAA ACA ACC ACT TTT GGA TAA C P3 CTC AAA GTG TAA GAT GCG CAA AAG P2 ACA CAA AGC TCT AGC CCT TC P4 AAA TTT GTT TAC TGT AAG AGA ATA TTG AAT C 表 1 引物信息
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注射1×107个感染P.yoelii 17XNL的红细胞至昆明小鼠体内，裂殖体密度达50%时将小鼠取血到肝素抗凝管中，加入3 mL RPMI1640培养基(HyClone公司)，混匀，室温2 500 r/min离心5 min，弃上清，用1640重悬沉淀；室温3 100 r/min离心20 min，小心吸取中间层(为浓集后含裂殖子的红细胞)加到提前备好的3 mL 50%percoll上；弃上清，沉淀同样用1640培养基混匀；室温2 500 r/min离心5 min，弃除上清，沉淀即为浓集后的疟原虫所得。将工具质粒、裂殖体与电转液混合加入电转杯，使用Lonza Nucleofector电转仪进行电击转染，电转后尾静脉注射昆明小鼠体内。次日查血，待镜检出现有疟原虫出现后每天给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水，隔天鼠尾采血镜检查疟原虫，至给药后第8天取鼠血进行PCR及测序鉴定。
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取PCR鉴定基因敲除成功的含虫鼠血接种至新一只昆明小鼠，待原虫血症达0.2%~1.0%，用0.9%氯化钠溶液稀释感染疟原虫的红细胞至0.7个iRBC/200μL，然后尾静脉注射至12只小鼠体内，每只200 μL，进行克隆化。鼠尾静脉注射后第8天，血涂片镜检小鼠感染情况，待原虫生长至0.2%~1.0%可提基因组DNA采用PALM基因外侧基因组特异性引物P1/P3进行PCR鉴定是否获得阳性克隆虫株。
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将PALM基因敲除的疟原单克隆株和P.yoelii 17XNL，按1×105个iRBC/200 μL 0.9%氯化钠溶液的接种量，分别尾静脉注射小鼠各6只。每2天鼠尾采血，记录并统计原虫血症。
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本研究经蚌埠医学院伦理委员会审查批准通过(批准号：伦动科批字[2022]第196号)。
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采用t检验。
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PCR扩增PALM左、右游同源臂各约600 bp，片段长度均符合预期(见图 2)，将左右游同源臂、sgRNA分步与pYCm-golden-blue质粒连接构建PALM敲除CRISPR工具质粒。对PALM敲除CRISPR工具质粒的sgRNA部分测序(见图 3)，其序列与设计序列一致，PALM敲除CRISPR工具质粒构建成功。
图 2 左右同源臂扩增结果
图 3 部分PALM敲除CRISPR工具质粒测序结果: sgRNA序列
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PALM敲除CRISPR工具质粒电击转染后感染疟原虫的红细胞接种7只小鼠，24 h后镜检均见疟原虫。喂药筛选后，镜检见给药后2 d原虫密度最高，后逐渐降低，至6 d降至最低，且仅5只小鼠镜检疟原虫阳性。给药后第8天，仅2只小鼠镜检见疟原虫，但原虫密度显著回升，7.5%~9.0%(见图 4)；取镜检疟原虫阳性小鼠血，以PALM基因外侧基因组特异性引物P1/P3进行PCR扩增后，在1 246 bp处可见条带(见图 5A)，用PALM基因内部引物P2/P4 PCR扩增未见条带(见图 5B)，而野生株则分别扩增出于预期相符的约2 200 bp和720 bp条带，提示成功获得P.yoelii 17XNL PALM敲除疟原虫。经测序发现，相较于P.yoelii 17XNL标准序列(PY17X_0102700)送测序列的PALM(954 bp) 完全缺失，进一步证实P.yoelii 17XNL PALM基因成功敲除(见图 6)。
图 4 电击转染后镜检查虫(瑞氏吉姆萨染色)
图 5 约氏疟原虫PALM KO虫株PCR鉴定结果
图 6 约氏疟原虫PALM KO虫株测序结果
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将含有PALM基因成功敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠进行单克隆筛选后第8天，采血镜检见12只小鼠中7只疟原虫阳性。用P1/P3引物对全部12只小鼠进行PCR鉴定，自7只小鼠血液中扩增出疟原虫阳性条带，其中2只扩增出单一的大小为1 246 bp的PALM基因缺失条带(见图 7)，PALM基因敲除单克隆约氏疟原虫筛选成功。
图 7 PALM基因敲除疟原虫的单克隆鉴定
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P.yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆株和P.yoelii 17XNL野生株分别经尾静脉注射感染小鼠后，每2天鼠尾取血染色镜检，结果发现2组小鼠原虫率均随时间延长而增长，至观察终点(感染后第10天)，P.yoelii 17XNL野生株组的疟原虫血症为(17.00±1.08)%；P.yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆株组的疟原虫血症为(17.42±1.39)%，2组小鼠疟原虫血症差异无统计学意义(P>0.05)。
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遗传减毒子孢子疫苗由于其遗传性状的稳定性，在制备过程中无毒力回复的风险，是较为理想的减毒子孢子疟疾疫苗策略。而红外期特异性表达的发育关键基因的鉴定与敲除是研发遗传减毒子孢子疫苗关键。PALM是近年来在伯氏疟原虫中鉴定出的一种定位于疟原虫顶生质体，于疟原虫红外期特异性表达的发育关键基因。尽管理论上其他疟原虫中PALM基因也具备此特征，但尚未有研究证实。鉴于不同疟原虫之间基因表达调控尽管大部分类似，但也存在着一些差异，故明晰PALM基因在其他疟原虫中的表达特征与功能是必要的。约氏疟原虫是一种实验室常用的鼠疟原虫。约氏疟原虫建立小鼠模型仅需10个甚至更少的子孢子，远低于伯氏疟原虫，这在生物学上更接近于恶性疟原虫的特点[21]；而且，约氏疟原虫的红外期免疫的建立的特点也更接近于人类疟原虫的特征[18]。因而，相对于伯氏疟原虫鼠疟模型，约氏疟原虫鼠疟模型被认为是研究红外期疟疾免疫及减毒子孢子疟疾疫苗更加理想的模型[22-23]。因此，为了利用约氏疟原虫鼠疟模型探讨基于PALM基因构建遗传减毒子孢子疫苗的可能性，有必要构建约氏疟原虫PALM基因敲除株，以进一步探讨在约氏疟原虫红外期裂殖子发育中PALM的功能，
基因敲除技术近年来发展迅速，特别是CRISPR/Cas9技术的出现，将包括基因敲除在内的基因编辑技术提升至一个新的高度。与传统的基因编辑方式相比，CRISPR/Cas9技术具有更高的遗传操作效率和可靠性[9]。2014年，CRISPR/Cas9技术被成功用于疟原虫编辑，包括本团队在内的国内外研究者也已经利用CRISPR/Cas9技术开展了部分工作[24-26]。由于鼠疟原虫尚无法体外培养，利用CRISPR/Cas9技术进行鼠疟原虫基因编辑必须在小鼠模型体内进行筛选，难度远高于可体外连续培养的恶性疟原虫基因编辑，故采用CRISPR/Cas9技术对鼠疟原虫进行基因编辑的研究尚不多见。国内袁晶教授团队构建了含乙胺嘧啶和5-氟胞嘧啶抗性基因的单质粒系统质粒pYCm，使利用CRISPR/Cas9技术对鼠疟原虫进行基因编辑和筛选更加可行。我们团队在袁晶教授馈赠的质粒pYCm基础上改建获得了pYCm-golden-blue质粒[27]，增添了重组阳性克隆的蓝白斑筛选功能，提高了阳性克隆的筛选效率。
本研究中，我们利用改造的pYCm-golden-blue质粒基于CRISPR/Cas9技术进行了约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因敲除，经乙胺嘧啶小鼠体内筛选后获得了阳性疟原虫，经PCR和测序验证表明PALM基因被成功敲除；而且，通过有限稀释法我们获得了单克隆化的P.yoelii 17XNL PALM基因敲除虫株。我们比较了PALM基因敲除虫株和野生株约氏疟原虫感染后的小鼠疟原虫血症水平，发现二者无显著差异，表明PALM基因敲除对约氏疟原虫红内期生长发育无重要影响，是红内期发育的非必须基因，这与PALM在伯氏疟原虫红内期发育中作用一致，也进一步提示PALM基因在约氏疟原虫红外期发育的作用非常可能也与其在伯氏疟原虫红外期的作用一致，是红外期发育的关键基因。这些为后续深入研究基于PALM基因的遗传减毒子孢子疫苗提供了基础。
基于CRISPR/Cas9的PALM基因敲除约氏疟原单克隆虫株的构建
Construction of monoclonal PALM gene knockout strain of Plasmodium yoelii based on CRISPR/Cas9 technique
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摘要:
目的基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。 方法根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息, 设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂, 将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接, 构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体, 尾静脉注射感染小鼠, 24 h后采血查获疟原虫后, 给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫, 喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定, 最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠, 8 d后采血镜检疟原虫, PCR鉴定, 筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内, 每只接种1×105感染疟原虫的红细胞(iRBC)。对感染后的小鼠每2天鼠尾取血制作血涂片, 经吉姆萨染色后镜检计算原虫率, 记录数据进行统计学分析。 结果PCR扩增出的PALM左右同源臂各600 bp以及sgRNA序列, 与载体pYCm-golden-blue连接后成功获得用于电转染的PALM基因敲除的CRISPR质粒。该质粒电转染的疟原虫在小鼠体内经药物压力筛选8 d, 用PALM基因内部引物经PCR检测显示PALM基因缺失, 用基因组特异性引物经PCR检测出现阳性重组条带, 片段长度1 246 bp。随后将阳性重组条带切胶测序, 测序结果进一步证实PALM基因敲除成功。在获得约氏疟原虫PALM基因敲除株的基础上, 通过有限稀释感染12只小鼠, 经PCR自2只小鼠血液中扩增出单一PALM基因敲除条带, 检测不到野生型疟原虫的残留, 获得了2个100%PALM基因敲除的单克隆虫株。PALM基因敲除单克隆株与P.yoelii 17XNL感染小鼠后均出现原虫血症, 且2组小鼠原虫率逐日升高。感染后第10天, 2组小鼠原虫血症水平差异无统计学意义(P>0.05)。 结论成功构建并单克隆化PALM基因敲除的P.yoelii 17XNL虫株, 为疟疾遗传减毒红前期活疫苗研发提供准备。 -
关键词:
- 约氏疟原虫 /
- PALM基因 /
- 基因敲除 /
- CRISPR/Cas9
Abstract:ObjectiveTo construct and identify monoclonal Plasmodium yoelii 17XNL PALM gene knockout strain based on CRISPR/Cas9 technique. MethodsAccording to the sequence information of P.yoelii 17XNL PALM gene in PlasmoDB database, primers and sgRNA were designed, and the left and right homologous arms were amplified by PCR.The homologous arms and sgRNA were ligated with vector pYCm-golden-blue to construct CRISPR tool plasmid pYCm-PALM KO for gene knockout.pYCm-PALM KO plasmid was transfected into P.yoelii 17XNL by electroporation.Twenty-four hours after the transfected parasites were injected into the mice via tail vein, the blood of mice was collected for examination of Plasmodium.The Plasmodium-positive mice were fed 6 mg/mL pyrimethamine to screen PALM gene knockout malaria parasites.After that, the blood was collected from the mice every 2 days and smears were taken for microscopic examination of malaria parasites.On the 8th day of screening, PCR and sequencing were performed to identify whether PALM gene knockout was successful.The red blood cells infected with PALM gene knockout malaria parasites were injected into the mice by limited dilution method.Eight days later, the blood of mice were collected to detect Plasmodium with microscopic examination and identify by PCR to screen monoclonal malaria parasite strains.The obtained PALM gene knockout monoclonal strain and P.yoelii 17XNL were inoculated into 6 Kunming mice, each inoculated with 1×105 Plasmodium-infected red blood cells (iRBC).The infected mice were collected every two days to make blood smears, and the protozoa rate was calculated by Giemsa staining posterior microscopy, the data were recorded, and the SPSS 19.0 software was used for statistical analysis. ResultsPlasmodium electrotransfected with this plasmid was screened by drug stress in mice for 8 days.The 600bp left and right homologous arms of PALM and sgRNA sequence amplified by PCR were ligated with the vector pYCm-golden-blue to obtain the CRISPR tool plasmid pYCm-PALM KO for PALM gene knockout, which was then successfully transfected into P.yoelii.The Plasmodium transfected with the plasmid pYCm-PALM KO was screened by drug pressure in mice.On the 8th day of screening, The PALM gene was detected by PCR with the internal primer of the PALM gene, and the positive recombination band was detected by PCR with the genome-specific primer, and the fragment length was 1 246 bp.The positive recombination bands were subsequently excised and sequenced, The sequencing results further confirmed that the PALM gene was knocked out successfully.On the basis of obtaining the PALM knockout strain of P.yoelii, 12 mice were infected by limiting dilution, and a single PALM knockout band was amplified from the blood of two of the mice which were used for monoclonal screening of PALM gene knockout Plasmodium parasites by PCR, and the wild-type Plasmodium could not be detected.2 monoclonal strains with 100% PALM gene knockout were obtained.The parasitemia increased with time in the two groups of mice infected with PALM gene knockout monoclonal strain and P.yoelii 17XNL wild-type strain respectively.On day 10 post infection, there was no significant differences in parasitemia levels between the two groups (P>0.05). ConclusionsP.yoelii PALM gene knockout strain was successfully constructed and monocloned, providing preparation for the development of live attenuated pre-erythrocyte malaria vaccine. -
Key words:
- Plasmodium yoelii /
- PALM gene /
- gene knockout /
- CRISPR/Cas9
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表 1 引物信息
名称 序列 LHA-F GGC TAC GGT CTC GGG AGA TAA GAG AGT CTT TTG TAC AAC LHA-R GGC TAC GGT CTC TTT CAT ATT TTT GCG CAT TTT TTG CCT TGA AGG GTT AAA G RHA-F GGC TAC GGT CTC TTG AAT GCA ACA TTA ATA AAA ATT AAA TAA G RHA-R GGC TAC GGT CTC CAT GGT ATG TCA AAA TTA TGC ATA AAT ATA TTG sgRNA Fw GAT GAT AAT AGT AGA AAC GGA sgRNA Rv TCC GTT TCT ACT ATT ATC ATC P1 GCG AAA ACA ACC ACT TTT GGA TAA C P3 CTC AAA GTG TAA GAT GCG CAA AAG P2 ACA CAA AGC TCT AGC CCT TC P4 AAA TTT GTT TAC TGT AAG AGA ATA TTG AAT C 
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图(7)表(1)
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